鹽酸頭孢噻呋無菌檢查方法的建立

劉霄飛,徐恩民*，張 琦，馮修光，郭 騰，章安源，王 燕

(1.山東省畜產品質量安全中心，濟南 250102；2.山東省飼料獸藥檢測中心，濟南 250102)

鹽酸頭孢噻呋，別名頭孢噻呋鹽酸鹽，鹽酸頭孢替呋，頭孢替呋鹽酸鹽，屬于第三代頭孢菌素類抗生素。頭孢噻呋作為第一個專門用于動物的第三代頭孢菌素類抗生素，因其具備抗菌活性強，β-內酰胺環穩定性好，毒副作用小，殘留量低，不易產生耐藥性或交叉耐藥性等優點，其制劑在獸醫臨床上被廣泛應用于防治豬、牛、羊及雛雞的呼吸系統等疾病[1-3]。鹽酸頭孢噻呋在《中華人民共和國獸藥典》尚未收載，其無菌檢查的方法也未見報道。目前國內檢測標準有農業部865號公告和1140號公告，且兩個公告的檢測對象為非無菌原料，均沒有無菌檢查項目。鹽酸頭孢噻呋無菌原料供無菌制劑使用時，存在一定的安全隱患。為了更好的對該無菌原料進行安全性評價和質量控制，確保其無菌制劑臨床用藥的安全性，本試驗對鹽酸頭孢噻呋無菌原料的無菌檢查方法進行研究，建立可靠的無菌檢查方法并進行方法適用性試驗。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 儀器設備 SHP150型生化培養箱(上海精宏試驗設備有限公司)；KB240型生化培養箱(德國BINDER)；BT125D型電子天平(德國賽多利斯科學儀器有限公司)；HTY-APL01型集菌儀(浙江泰林生物技術股份有限公司)；HG-50型全自動滅菌鍋(HIRAYAMA株式會社)；KDGB330型全封閉無菌過濾培養器(浙江泰林生物技術股份有限公司)。

1.1.2 供試品 鹽酸頭孢噻呋無菌原料分別由艾美科健生物醫藥有限公司(批號：PS077-1802001)；齊魯晟華制藥有限公司(批號：80671025A)。

1.1.3 試驗菌種 金黃色葡萄球菌[CMCC(B)26003]、大腸埃希菌[CMCC(B)44102]、銅綠假單胞菌[CMCC(B)10104]、枯草芽孢桿菌[CMCC(B)63501]、生孢梭菌[CMCC(B)64941]、白色念珠菌[CMCC(B)98001]和黑曲霉[CMCC(B)98003]，均購自中國食品藥品檢定研究院。

1.1.4 培養基與試劑 硫乙醇酸鹽流體培養基(批號：180830)、胰酪大豆胨液體培養基(批號：180820)、胰酪大豆胨瓊脂培養基(批號：180820)、沙氏葡萄糖液體培養基(批號：180731)、沙氏葡萄糖瓊脂培養基(批號：180912)、0.85%無菌氯化鈉溶液(批號：180226)和pH 7.0氯化鈉-蛋白胨緩沖液(批號：180820)，均購自北京陸橋技術股份有限公司。無水碳酸鈉(批號：20180125)購自國藥集團化學試劑有限公司。頭孢菌素酶(β-內酰胺酶Ⅱ，規格：不少于200萬單位/支，批號：7041837D)購自杭州北望生物科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 菌液制備 首先將試驗所需的7種菌分別進行復蘇復壯。再將金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌、大腸埃希菌的新鮮培養物接種至胰酪大豆胨液體培養基中，將生孢梭菌的新鮮培養物接種至硫乙醇酸鹽流體培養基中，30～35 ℃培養18～24 h；將白色念珠菌的新鮮培養物接種至沙氏葡萄糖液體培養基中，20～25 ℃培養24～48 h；將黑曲霉菌的新鮮培養物接種至沙氏葡萄糖瓊脂斜面培養基上，20～25 ℃培養5～7 d，再加入3～5 mL含0.05%(mL/mL)聚山梨酯80的 0.85%無菌氯化鈉溶液，將孢子洗脫，制成孢子懸液。上述培養物和孢子懸液均用0.85%無菌氯化鈉溶液10倍稀釋制成每1 mL含活菌數/孢子數<100 CFU的菌懸液，培養后活菌計數。

1.2.2 培養基適用性檢查

1.2.2.1 培養基無菌性檢查 隨機取硫乙醇酸鹽流體培養基和胰酪大豆胨液體培養基各5支，置規定的溫度下培養14 d。

1.2.2.2 培養基靈敏度檢查 取每管裝量為12 mL的硫乙醇酸鹽流體培養基7支，分別接種<100 CFU的金黃色葡萄球菌、銅綠假單包菌、生孢梭菌各2支，另1支不接種作為空白對照，培養3 d；取每管裝量為9 mL的胰酪大豆胨液體培養基7支，分別接種<100 CFU的枯草芽孢桿菌、白色念珠菌、黑曲霉各2支，另1支不接種作為空白對照，培養5 d。

1.2.3 供試品前處理 取供試品500 mg，加10 mL 2.6%無菌碳酸鈉溶液使溶解，再轉移至490 mL 0.85%無菌氯化鈉溶液中，作為供試液過濾。

1.2.4 沖洗總量的考察 選擇常用的pH 7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液為沖洗液，分別對供試品進行300、400、500 mL/膜的沖洗后，加入<100 CFU的金黃色葡萄球菌，30～35 ℃條件下培養24 h。

1.2.5 無菌檢查法適用性試驗(薄膜過濾法)

1.2.5.1 供試品陽性菌試驗組 用建立的方法對供試品進行操作，在最后一次沖洗液中分別加入<100 CFU的菌液，過濾后，每個濾筒內灌注培養基，其中金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、生孢梭菌在硫乙醇酸鹽流體培養基中，30～35 ℃條件下培養5 d，枯草芽孢桿菌、白色念珠菌、黑曲霉在胰酪大豆胨液體培養基中，20～25 ℃條件下培養5 d，各2組。

1.2.5.2 陽性菌對照組 取6個無菌封閉式濾筒，其中3個濾筒加入硫乙醇酸鹽流體培養基，分別接種<100 CFU的金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、生孢梭菌，30～35 ℃條件下培養5 d；另3個濾筒加入胰酪大豆胨液體培養基，分別接種<100 CFU的枯草芽孢桿菌、白色念珠菌、黑曲霉，20～25 ℃條件下培養5 d。

1.2.5.3 供試品組 取供試品，除不加陽性菌外，與供試品陽性菌試驗組同法處理。再分別加入硫乙醇酸鹽流體培養基和胰酪大豆胨液體培養基，置規定溫度下培養5 d。

1.2.5.4 陰性對照組 取2個無菌封閉式濾筒，用0.85%無菌氯化鈉溶液和pH 7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液沖洗，沖洗次數與沖洗量與試驗組相同，向濾筒中分別加入硫乙醇酸鹽流體培養基和胰酪大豆胨液體培養基，置規定溫度下培養5 d。

1.2.6 加酶與否的考察 與1.2.5.1項和1.2.5.3項同法操作，并在每筒培養基內加入一支用1 mL 0.85%無菌氯化鈉溶液溶解的頭孢菌素酶溶液進行考察。

2 結果與分析

2.1 活菌計數 活菌計數結果見表1。由表1可知，經倍比稀釋后，7種菌的菌懸液活菌計數結果均符合要求，可作為試驗菌液。

表1 活菌計數結果

2.2 培養基適用性檢查

2.2.1 培養基無菌性檢查 經培養，硫乙醇酸鹽流體培養基和胰酪大豆胨液體培養基均無菌生長，表明這兩種培養基的無菌性檢查符合要求。

2.2.2 培養基靈敏度檢查 培養基靈敏度檢查結果見表2。由表2可知，各試驗菌株在對應的硫乙醇酸鹽流體培養基和胰酪大豆胨液體培養基中，經特定的時間培養后均生長良好，空白對照管無菌生長，表明這兩種培養基的靈敏度符合要求。

表2 培養基靈敏度檢查結果

2.3 沖洗總量 試驗結果見表3。由表3可知，300、400 mL/膜的沖洗筒，菌雖然生長，但較陽性對照筒生長得弱一些，500 mL/膜沖洗筒，菌生長良好，與陽性對照筒生長情況相同，表明供試品抑菌作用完全消除。因此，確定沖洗總量為500 mL/膜(每張濾膜每次沖洗量為100 mL，沖洗5次)。

表3 沖洗總量考察結果

2.4 方法適用性試驗 方法適用性試驗結果見表4、表5，由表4、表5可知，6種試驗菌株均生長良好，表明該試驗方法能有效消除鹽酸頭孢噻呋對各試驗菌株的影響。

表4 方法適用性試驗結果(供試品陽性菌試驗組與陽性菌對照組)

表5 方法適用性試驗結果(供試品組與陰性菌對照組)

2.5 加酶與否 通過加酶與否考察試驗得出，加頭孢菌素酶與不加頭孢菌素酶，對試驗結果沒有影響，說明供試品經500 mL/膜pH 7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液充分沖洗后，可完全消除供試品自身的抑菌作用，不需另加頭孢菌素酶來中和供試品的抑菌活性。

2.6 供試品無菌檢查 分別取兩個廠家的供試品，按照驗證過的無菌檢查方法進行檢查。結果顯示，陽性對照菌在24 h內均生長良好，陰性對照14 d內均澄清，無菌生長，供試品14 d內澄清，無菌生長，無菌檢查結果符合規定。

3 討論與結論

3.1 供試品的取樣量及溶解介質 鹽酸頭孢噻呋不溶于水，由其分子式可知鹽酸頭孢噻呋在水中顯酸性，經試驗驗證能夠在碳酸鈉溶液、氫氧化鈉溶液中溶解[4]。考慮到溶解介質對微生物的影響并借鑒頭孢噻呋的無菌檢查方法[5]，本試驗選用2.6%無菌碳酸鈉溶液作為溶解介質。供試品取樣量依據無菌檢查法供試品的最少檢驗量[5]的要求，選擇了最少檢驗量500 mg，通過逐步增加溶解介質觀察供試品溶解情況的方法，最終確定500 mg的供試品在10 mL 2.6%無菌碳酸鈉溶液中完全溶解。

3.2 沖洗液的用量 無菌檢查常見方法有直接接種法和薄膜過濾法，只要供試品性質允許，應采用薄膜過濾法[5]。薄膜過濾法是各國藥典收載的無菌檢查的首選方法，該方法具有操作簡便、結果準確等優點[6]。薄膜過濾法每張濾膜總沖洗量不得超過1000 mL，以免濾膜上的微生物受損傷[5]；一般要求固體供試品溶解后轉移至不少于500 mL的0.9%無菌氯化鈉溶液進行稀釋后再過濾，因此，沖洗液的用量不能超過500 mL，使總過濾量不超過1000 mL，以保證微生物檢出不受影響。

3.3 β-內酰胺酶的使用 鹽酸頭孢噻呋屬于β-內酰胺類抗生素，具有很強的抑菌作用[7]，具有抑菌活性的供試品無菌檢查時可以加入中和劑或滅活劑來消除供試品的抑菌活性[8]，本試驗對加β-內酰胺酶與不加β-內酰胺酶兩種方法做了比較，發現供試品經500 mL/膜pH 7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液充分沖洗后，可完全消除供試品自身的抑菌作用，不需要另加β-內酰胺酶中和，大大降低了試驗成本，簡化了試驗步驟。

本試驗成功建立了鹽酸頭孢噻呋無菌原料的無菌檢查方法。在該無菌檢查條件下可有效清除藥物自身的抑菌活性，提高了檢測效率，降低了檢測成本，為該無菌原料的安全性評價和質量控制提供了科學、可靠的技術支持。