黑老虎果實提取物對小鼠腹瀉模型的干預作用

凌智輝，張天鹿，曾建國，唐 其，吳領席，陸 英，*

(1.湖南農業大學園藝學院，長沙 410128;2.國家中藥材生產(湖南)技術中心，長沙 410128；3.湖南省通道縣農業局，懷化 418000)

黑老虎(Kadsuracoccinea(Lem.) A. C. Smith)別名冷飯團、過山龍藤、血藤泡、布福娜等，是木蘭科、南五味子屬藤本類植物。黑老虎作為一種民間藥物，藥物部位主要為根、莖，味辛、微苦、性溫，具有行氣止痛、散淤通絡的功效，主要用于治療風濕痹痛、跌打損傷、胃病及婦科病等[1]。現代研究表明，黑老虎根莖中主要化學成分有木質素類和三萜類，還有單萜類、倍半萜類、甾體類等，其中木脂素類化合物主要為聯苯環辛二烯型木脂素類，還有少量的芳基萘型和二芐基丁烷型木脂素類[2]，其他類型木脂素主要為芳基萘型木脂素 kadsuralignan C[3]、kadsuralignans H[4]和二芐基丁烷型木脂素 kadsuralignan G[5]；三萜類化合物有kadlongilactone型以及降三萜類等[6-7]；倍半萜有lospathulenol和naphthalene C等[8]。黑老虎中所得木脂素類化合物主要有抗腫瘤[9]、抗HIV[10]、保肝作用[11]、抗炎作用[12]；三萜類化合物具有抗腫瘤[13]、保肝作用[14]；其他類化合物還有抗氧化、調血脂、體外抑菌、殺蟲、神經保護等作用[15]。

近年來，黑老虎果實作為一種特色水果在我國南方發展速度較快，種植面積快速增加，但黑老虎果實存在果皮厚，籽多，果肉量少的缺點，亟待深加工綜合開發利用；筆者在黑老虎種植基地調研發現，當地老百姓有用黑老虎果皮治療腹瀉的案例，但未發現科學研究報導。腹瀉是人畜共患的一種多種因素引起的腸道疾病，多采用抗生素進行治療。近年來，由于抗生素類藥物的大量使用，導致藥物殘留和環境污染等問題，具有抗腹瀉作用的天然植物提取物替代抗生素成為人們研究的熱點。采用細菌性腹瀉小鼠和藥物性腹瀉小鼠模型對黑老虎果實提取物的主要成分及抗腹瀉作用進行研究，為新藥開發和畜禽養殖中疾病預防及治療提供新的天然抗腹瀉藥物，也為黑老虎產業可持續發展奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 雄性ICR小鼠210只，體重：18.0～22.0 g，購于湖南斯萊克景達實驗動物有限公司，實驗動物生產許可證號：SCXK(湘)2019-0004，動物質量合格證號：1107272011000001，1107272011000003，1107272011000329，在湖南省藥物安全評價研究中心屏障環境飼養，實驗動物使用許可證號：SYXK(湘)2015-0016。

1.1.2 實驗材料 黑老虎鮮果2019年11月采集于湖南省懷化市通道縣黑老虎種植基地；大腸埃希氏菌Escherichia coli(ATCC25922)；羧甲基纖維素鈉，批號：20170915，阿拉丁產品；蒸餾水。

1.2 儀器設備 ME2002E型電子天平，梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司產品。

1.3 方法

1.3.1 提取物制備 取黑老虎鮮果4000 g，用10倍40%乙醇在30 ℃超聲提取三次，每次60 min,將提取液抽濾并合并，55 ℃減壓回收乙醇，濃縮后冷凍干燥得黑老虎果實提取物。

1.3.2 提取物中主要成分含量檢測 分別以五味子酯甲、齊墩果酸、蘆丁為標準品，按文獻[16-18]方法采用分光光度法測定黑老虎果實提取物中的木脂素類、三萜類、黃酮類化合物含量。

1.3.3 劑量設置 設置黑老虎果實提取物低、中、高劑量為50 mg/kg、100 mg/kg、200 mg/kg。腸炎寧膠囊臨床推薦用量6 g，根據人與動物體表面積換算動物等效劑量為6 g*0.0026/0.02 kg=0.78 g/kg。

1.3.4 黑老虎果實提取物對小鼠細菌性腹瀉模型的影響 ICR小鼠60只，雄性，體重18.0～22.0 g，按體重隨機分為6組，每組小鼠10只，分別為：正常組、腸炎寧膠囊組、模型組、黑老虎果實提取物低、中、高劑量組。不同小組小鼠根據實驗需求灌胃給予不同藥物(表1)，連續給藥7 d，給藥體積為0.4 mL，每日給藥1次，正常對照組和模型對照組小鼠每天給予同體積蒸餾水。除正常組其余小鼠于末次給藥后30 min腹腔注射5×108CFU/mL的大腸埃希菌溶液，注射體積為0.4 mL。觀察并記錄各組小鼠注射大腸埃希菌后4 h內排便情況[19]，并計算小鼠腹瀉率與腹瀉指數。腹瀉率=腹瀉動物數/該組動物總數×100%；腹瀉指數=稀便率×平均稀便級。稀便率為小鼠所排的稀便數與總便數之比。稀便級通過稀便濾紙的污染程度(直徑大小)來進行分級，一共分為4級：小于1 cm為1級，1～1.9 cm為2級，2～3 cm為3級，大于3 cm為4級，不同級數表示每只動物稀便的程度的高低。平均稀便級=所有稀便級/稀便次數[20]。

表1 試驗分組和劑量設計

1.3.5 黑老虎果實提取物對番瀉葉致小鼠腹瀉模型的影響 ICR小鼠50只，雄性，體重：18.0～22.0 g，按體重隨機分為5組，小鼠同1.4.3方法處理。除正常組其余小鼠于末次給藥后30 min灌胃給予1 g/mL的番瀉葉提取液，灌胃體積為0.4 mL，灌胃后將小鼠單個置于自制鐵絲籠中，下方墊濾紙，濾紙間隔30 min更換1次，記錄小鼠首次出現腹瀉時間與6 h內稀便數量。

1.3.6 黑老虎果實提取物對小鼠小腸推進的影響ICR小鼠50只，雌雄各半，體重：18.0～22.0 g，按性別體重隨機分為5組，分別為：正常組、腸炎寧膠囊組、黑老虎果實提取物低、中、高劑量組，每組10只，每天小鼠進行灌胃，灌胃藥物劑量0.4 mL的相應藥物，1次每日，連續7天進行給藥，正常組小鼠灌胃0.4 mL蒸餾水，各組小鼠末次給藥后30 min灌胃給予5%碳末，0.2 mL/只，30 min后處死小鼠，參照文獻方法[21]，計算小腸碳末推進率。碳末推進率(%)=碳末在腸內推進距離/小腸全長×100%。

2 結果與分析

2.1 黑老虎主要化學成分定量檢測 由圖1可見，三個標準曲線R2>0.99，證明該方法線性范圍良好，可用于含量測定。黑老虎果實提取物中木脂素、三萜和黃酮類化合物總量達到63%，其中木脂素類化合物含量最高。

圖1 標準曲線圖

表2 黑老虎果實提取物中主要化學成分含量

2.2 黑老虎果實提取物對小鼠細菌性腹瀉模型的影響 由表3可知，模型對照組相對于正常組，小鼠的腹瀉潛伏時間明顯減少(P<0.01)，小鼠腹瀉指數明顯增加(P<0.01)，表明造模成功。相對于模型組，腸炎寧組、黑老虎果實提取物低、中、高劑量組小鼠腹瀉潛伏時間均有所延長，腹瀉指數有所減少，其中黑老虎果實提取物低、高劑量組小鼠腹瀉潛伏時間明顯增加(P<0.05)，高劑量組腹瀉指數明顯減少(P<0.05)。黑老虎果實提取物低、中、高組小鼠腹瀉率分別是：40%、40%、20%，相對于模型組都有所減少。黑老虎果實提取物高劑量組潛伏時間顯大于腸炎寧組，腹瀉指數顯小于腸炎寧組，腹瀉率低于腸炎寧組。

表3 黑老虎果實提取物對小鼠細菌性腹瀉模型的影響(n=10)

2.3 黑老虎果實提取物對番瀉葉致小鼠腹瀉模型的影響 如表4所示，相比于正常組，模型組小鼠腹瀉潛伏時間明顯減少(P<0.05)，稀便數量明顯增加(P<0.01)。相對于模型組，腸炎寧膠囊組潛伏時間明顯減少(P<0.05)，稀便數量有所減少，但不明顯；黑老虎果實提取物低、中、高劑量組小鼠腹瀉潛伏時間都沒有明顯改變，稀便數量都有明顯減少(P<0.05)。相比于腸炎寧組，黑老虎果實提取物低、中、高劑量組潛伏時間都增加，稀便數量都有所減少；黑老虎低劑量組稀便顆數有顯著差異。

表4 黑老虎果實提取物對番瀉葉致小鼠腹瀉模型的影響(n=10)

2.4 黑老虎果實提取物對小鼠小腸推進的影響 由表5可知，與正常組相比，黑老虎果實提取物低、中、高劑量組小鼠小腸碳末推進率無明顯差異(P>0.05)，腸炎寧膠囊組小鼠小腸碳末推進率有所增加。與腸炎寧膠囊組相比，黑老虎果實提取物低、中、高劑量組小鼠小腸碳末推進率有所減少，但無顯著差異。

表5 黑老虎果實提取物對小鼠小腸推進的影響(n=10)

3 討論與結論

文獻研究表明，具有抗腹瀉的天然化學成分主要有鞣質類[23]、生物堿類[24-25]、三萜類、揮發油類[26]、黃酮類[27]、多酚類[27]、多糖及其他類化合物，主要從調節水和電解質平衡、抗炎、干預胃腸激素分泌、保護腸黏膜、促進腸道修復等方面作用；實驗對黑老虎果實提取物中主要成分測定表明，提取物中含有較高的木脂素、三萜和黃酮類化合物，這三類成分均具有較好的抗炎作用。因此，可以推測，它們是黑老虎果實提取物具有抗腹瀉作用的物質基礎，且主要是通過抑制腸道炎癥而產生抗腹瀉作用，但具體作用機理還有待于進一步研究，具體化學組成也有待進一步分離與鑒定。

黑老虎果實提取物對細菌性致腹瀉具有良好的抗腹瀉作用，為新藥開發和畜禽養殖中疾病預防及治療提供了新的天然抗腹瀉藥物，也為黑老虎產業可持續發展奠定基礎。