痘病毒編碼的蛋白對NF-κB信號通路調控作用研究進展

王憲軍，向 華

（西南民族大學畜牧獸醫學院，四川 成都 610041）

NF-κB是機體先天性免疫和獲得性免疫的重要核轉錄因子，對機體免疫系統的調節起關鍵性作用[1-2]。在病毒感染宿主的初期，病毒誘導宿主細胞NF-κB等信號通路的活化，產生以干擾素（IL）-1α、IL-6和IL-8細胞因子為主的信號分子，調節宿主天然免疫應答。經典的NF-κB信號通路激活方式與天然免疫反應密切相關，即當細胞受病毒感染時，經過細胞質內一系列的信號轉導后，最終將信號匯集到IκB激酶復合體（IKK），使其活化，導致IκBα磷酸化，以及泛素化，隨后在26s蛋白酶體的作用下IκBα發生降解，從而導致NF-κB的釋放。

盡管病毒的感染能引起宿主的免疫應答，但目前研究已證實，在感染哺乳動物的病毒中，痘病毒科、黃病毒科、皰疹病毒科、非洲豬瘟病毒科、呼腸孤病毒科和布尼病毒科家族等病毒擁有NF-κB活性的抑制劑，存在抑制NF-κB信號通路的現象[3-5]。痘病毒是目前已知基因序列大、復雜及宿主譜廣的病毒[6]，具有獨特的調節宿主各種免疫應答過程的能力，特別是痘病毒編碼的蛋白對NF-κB信號轉導系統進行調控，有利于病毒在宿主細胞內復制，進而逃逸宿主的免疫應答[7-8]。盡管在痘病毒科屬疾病防控中出現了一些有力的、典型的免疫反應方面抗病毒的藥物，但正由于痘病毒存在逃逸宿主的免疫應答的能力，導致病毒不斷地逃逸免疫保護，如在實際生產中羊群出現反復感染病毒的現象。因此探索痘病毒科編碼的蛋白調節NF-κB信號通路的機制已成為目前痘病毒研究的熱點。本研究主要綜述近些年痘病毒編碼的蛋白通過不同的途徑調節NF-κB信號通路的調控作用，為進一步對宿主細胞早期抗病毒的免疫應答方面的研究奠定基礎。

1 NF-κB信號通路及其調控機體天然免疫應答的作用

在病毒感染宿主的初期，病毒誘導宿主細胞NF-κB等信號通路的活化，產生以細胞因子為主的信號分子，調節宿主天然免疫應答。宿主細胞利用自身分泌的Ⅰ型干擾素IFNs（IFN-α和IFN-β）干擾病毒的復制。然而，病毒快速地進化出獨特的致病機理，削弱宿主細胞天然抗病毒免疫，特別是針對在機體天然免疫早期起重要作用的NF-κB信號通路的抑制作用[9]。

NF-κB是一種廣泛存在于多種真核細胞的核轉錄因子，調控細胞一系列基因的表達，進而影響機體先天免疫和獲得性免疫、細胞應激反應、細胞黏附、以及細胞凋亡和增殖[10-11]。哺乳動物細胞內，NF-κB家族由NF-κB1（p50/p105）、NF-κB2（p52/p100）、RelA（p65）、RelB和c-Rel 5種相關聯的轉錄因子組成[12]，通常以二聚體的形式存在于細胞內，不同的二聚體識別特異DNA調控基因的轉錄。RelA（p65）、RelB和c-Rel蛋白的N端為Rel同源結構域（RHD），對二聚體的形成和DNA的結合發揮作用，而C端為調節轉錄的活性區域。NF-κB1（p50）、NF-κB2（p52）分別作為p105和p100的前體蛋白，N端為Rel同源結構域（RHD），C端為錨蛋白重復序列區，對泛素依賴的蛋白酶解加工發揮著作用。NF-κB常見的組成形式是p50/p65異二聚體。大部分細胞質內，IκB蛋白通過其N端的錨蛋白重復序列區與p50/p65異二聚體相結合，形成IκBα/p65/p50復合體，遮擋了NF-κB的核定位序列，從而導致NF-κB以非活性的形式存在于細胞質內[13]。

NF-κB信號通路的活化是一個復雜的過程，且受多種刺激的影響，如細菌、病毒、細胞因子、DNA損傷、氧化應激和輻射等[14]。目前對于NF-κB信號通路活化機制的研究已在人[15]、豬[16]、鼠[17]、兔[18]、牛[19]和羊[20]等物種中證實，且具有高度的物種保守性。NF-κB的激活途徑主要分經典途徑和非經典途徑，經典途徑的激活方式與天然免疫反應密切相關，即當細胞受病毒感染或其他促炎介質刺激時，經過細胞質內一系列的信號轉導后，最終將信號匯集到IκB激酶復合體（IKK），使其活化，導致IκBα磷酸化（在IκBα的Ser32、Ser36），隨后磷酸化的IκBα被泛素化，即在含有F-box結構域的泛素連接酶復合物SCF（SkpI-Cull-FBP）作用下使IκBα的Lys21和Lys22上發生泛素化，隨后在26s蛋白酶體的作用下IκBα發生降解，從而導致NF-κB的釋放[21-22]。同時IKK也存在負調控的作用，主要是IKKβ上C端絲氨酸的磷酸化作用，從而抑制NF-κB信號通路的活化[23]。隨著NF-κB釋放到細胞核后，其連接到一個DNA共有序列5'-GGGACTTTCC-3'（κB成分），隨后在細胞核內啟動第二水平的轉錄活性調控，主要包括NF-κB的磷酸化和乙?；饔?，即RelA在蛋白激酶A（PKA）的作用下發生磷酸化，從而促進NF-κB與轉錄因子CBP/p300的結合，有力地增強基因的反式激活作用。同時，糖原合成酶激酶（GSK-3β）對于NF-κB轉錄活性的調節也具有作用，而NF-κB直接或可逆的乙?；幻枋鲎鳛镹F-κB活性額外的調節機制作用[24]。在NF-κB通路非經典途徑中，NF-κB2（p100）與RelB形成異源二聚體，當細胞受到淋巴毒素β受體（LTβR）、腫瘤壞死因子家族的B細胞活化因子（BAFF）、CD40配體等因子刺激時，p100的C端兩個位點磷酸化依賴的泛素化降解后加工成p52，一旦降解，p52的N端被釋放，導致p52-RelB二聚體的細胞核移位，啟動靶基因轉錄和表達[25]。

阻礙NF-κB信號通路活化的病毒抑制劑分為兩類：一種為病毒分泌的配體，通過與可溶性的病毒受體或者細胞因子的相互作用來阻礙NF-κB活化信號的啟動；另一種是細胞內存在的NF-κB抑制劑，主要為病毒編碼的蛋白，這些蛋白往往存在錨蛋白重復序列（ankyrinrepeat,ANKs）和PYD域NF-κB抑制劑，在細胞內影響NF-κB信號通路[4]。

2 痘病毒編碼的蛋白對NF-κB信號通路的調控作用

抑制細胞內NF-κB活性的功能已在痘病毒家族內存在，且NF-κB信號通路是痘病毒家族抑制和逃避宿主免疫應答的主要靶點[26-27]。阻礙NF-κB信號通路活化的痘病毒抑制劑同樣包括病毒分泌的配體和細胞內存在的NF-κB抑制劑，即病毒編碼的蛋白。例如，黏液瘤病毒（Myxoma virus,MYXV）分泌的可溶性T2蛋白，在1991年首次被鑒定為細胞因子TNF的受體（vTNFR），T2蛋白與TNF結合后抑制了宿主細胞質內NF-κB的激活[28]。天花病毒（Variola,VARV）、猴痘病毒（Monkeypow virus,MPXV）和豬痘病毒（Swinepox virus）編碼一種能與IL-18結合的蛋白，通過阻止NF-κB的激活來調節宿主的抗病毒能力[29]。細胞內存在的NF-κB抑制劑，即病毒編碼的蛋白主要通過以下4種途徑抑制NF-κB信號通路。

2.1 抑制依賴宿主細胞內Toll樣受體（Toll-like receptors,TLRs）介導的NF-κB的激活

如痘苗病毒（Vaccinia virus,VACV）編碼的蛋白A46和A52，兩者與TIR的胞漿內結構域具有氨基酸序列相似性。研究已證實，A52能通過TLR家族成員，包括IL-1R、IL-18R、TLR4和TLR3的調節作用，使得A52與IRAK2和TRAF6的結合，從而抑制轉錄因子NF-κB的活化[30-31]。A46蛋白通過結合承接分子MyD88、MAL、TRIF和TRAM等蛋白阻止TIR結構域和承接分子之間的相互作用，從而干擾下游MAPK和NF-κB的激活[32]。羊口瘡病毒（Orf virus,ORFV）編碼的002蛋白通過抑制MSK1介導的NF-κB p65 Ser276的磷酸化，從而抑制NF-κB的轉錄活性[33]。VACA編碼的蛋白A52和K7能與腫瘤壞死因子受體相關分子6（TNF receptor-associated factor 6,TRAF6）相互作用，抑制其激酶活化，間接抑制NF-κB的激活[34]。

2.2 病毒編碼的蛋白通過與IKK復合物發生直接或間接的相互作用來抑制NF-κB信號通路

研究報道，VACV編碼的蛋白N1L能通過與IKKα、IKKβ、IKKγ、TBK1之間發生直接的相互作用，從而抑制NF-κB信號通路的活化[35]。傳染性軟疣病毒（Molluscum contagiosum virus,MCV）編碼的蛋白MC160，通過與Hsp90和蛋白酶-8的結合，抑制Hsp90與IKKα之間的相互作用，從而降低IKKα的穩定性，抑制NF-κB活性[36]。2008年Chen等研究發現，VACV編碼的蛋白B14R，能通過特異性地與IKKβ相互作用，抑制IKKβ的Ser177和Ser181發生磷酸化，從而抑制NF-κB的活化[37]。VACV編碼的錨蛋白K1L可通過抑制IκBα的降解從而阻斷兔腎細胞（RK-13）TLR2、TLR4和TLR9介導的NF-κB信號通路[38]。在病毒感染的早期，ORFV 119基因編碼的蛋白以依賴視網膜母細胞瘤蛋白（retinoblastoma protein,pRb）抑制IκB激酶（IκB kinase,IKK）復合物的激活，從而抑制NF-κB信號通路[39]。ORFV073與MCV編碼的蛋白MC005都可通過與IKK亞基NEMO結合來抑制IKK復合物的活性，從而抑制NF-κB信號通路[40-41]。VACA編碼的蛋白B15，可通過與IKK復合物的結合抑制IκBα的磷酸化和降解。

2.3 病毒編碼的蛋白通過與SCFβ-TrCP復合物的相互作用來抑制NF-κB的活化

例如，VARV編碼的蛋白G1R，VACV編碼的蛋白CP77，其C末端的F-box樣結構域與SCF復合物中的Skp1蛋白結合而阻止IκBα蛋白磷酸-泛素化降解而抑制NF-κB的活化[42-43]。

2.4 與轉錄因子NF-κB的相互作用來影響NF-κB的信號通路

VACV編碼的CP77蛋白通過其末端的6個ANK重復基序以及C末端的F-Box樣結構域共同結合NF-κB-p65而抑制NF-κB信號轉導活性[44]；MYXV編碼的蛋白M150，被認為是黏液瘤核轉錄因子（MNF），含有與IκBα的核定位信號序列（ANK重復序列）相似性，已顯示該蛋白與p65具有共區域化，從而削弱了p65的轉錄活性以及負向的調控依賴NF-κB活化信號因子的產生[45]。MCV編碼的M150R蛋白可通過其第8個ANK基序干擾NF-κB的核轉移，進而影響其免疫調控活性[46]。在細胞漿，ORFV 121基因編碼的NF-κB抑制劑能和NF-κB-p65 發生物理性結合，抑制NF-κB-p65的磷酸化和核轉運，從而阻止了免疫相關基因的轉錄和翻譯[47]。

3 具有多個多錨蛋白重復（ANKs）基序的錨蛋白參與NF-κB信號通路調控的作用及展望

錨蛋白重復序列（ankyrin repeat,ANKs）是普遍存在于生物體中的一種由33個氨基酸殘基基序組成的蛋白質序列模體，由兩個α螺旋和一個loop區構成，在細胞信號轉導、細胞骨架完整性、細胞周期調控、免疫應答、蛋白轉運等過程中均具有重要作用[48]。ANKs不僅存在于生物體，也存在于痘病毒編碼的蛋白，而其他病毒幾乎不編碼錨蛋白。錨蛋白作為痘病毒編碼的蛋白中最大的家族，其特征是具有ANKs的N末端和1個F-Box樣的C末端結構域[49-51]。已有研究報道，與痘病毒編碼的蛋白相似，錨蛋白可通過多層次的方式來影響NF-κB信號通路。

例如，VARV編碼的蛋白G1R，VACV編碼的蛋白CP77，兩者均可通過其N端的ANK重復基序，分別與NF-κB1/p105，NF-κB p65蛋白直接或間接結合抑制宿主NF-κB的活化[42-43，52]。2014年Lamb等發現，MYXV編碼的錨蛋白M-T5、M148R、M149R和M150R均能抑制NF-κB p65蛋白從細胞質遷移到細胞核，減少細胞核內NF-κB p65的聚集，抑制或者降低NF-κB信號通路的活性[53]。同樣VACV編碼的蛋白K1L可通過對NF-κB信號途徑不同位點的作用而調控宿主的天然抗病毒免疫應答[54]。對牛痘（Cowpox virus）ANK重復蛋白cpxv-006功能作用的敲除研究表明，cpxv-006突變體能夠誘導NF-κB p105亞單位的降解，這對NF-κB活性的調節有明顯的影響[43]。ORFV編碼5個結構相似的錨蛋白，即ORF008、ORF123、ORF126、ORF128和ORF129，它們都具有個數不等的ANK基序和1個F-box-like結構域[55]。對于ORFV編碼的5種錨蛋白，ORF008、ORF123能阻止經TNF-α刺激NF-κB活化后IκBα蛋白磷酸化降解過程并能抑制NF-κB p65蛋白核移位，而影響NF-κB信號轉導途徑[56]。ORF128蛋白在病毒感染早期表達且定位于宿主的細胞核，通過抑制IκBα蛋白磷酸化降解過程，阻止NF-κB p65蛋白核移位，進而抑制宿主NF-κB信號通路的活化[57]。ORF126蛋白表達后靶向定位于線粒體內，且ORF126編碼的AR8和AR9對錨蛋白定位于線粒體內起著關鍵性的作用，對于ORF126蛋白的功能目前不清楚，仍需進一步研究[48]。ORF129含有6個ANK基序的N末端和1個F-Box樣的C末端結構域，由此推測ORFV編碼的ORF129蛋白也可能通過抑制NF-κB p65和SCF、E3泛素連接酶復合物，阻止NF-κB遷移至細胞核，以逃避宿主的天然免疫應答[58]。因此，痘病毒編碼的蛋白，特別是痘病毒內具有ANKs基序的錨蛋白，可能通過對NF-κB信號途徑的不同位點的作用而調控宿主的天然抗病毒免疫應答，這也是豐富痘病毒感染宿主細胞的致病機理方面研究發展的方向。

4 小結

痘病毒編碼的蛋白通過影響與宿主天然免疫密切相關的NF-κB信號通路，有利于病毒在宿主細胞內的復制，導致病毒不斷地逃逸免疫保護而出現病毒的反復感染。因此，探索痘病毒編碼的蛋白調節NF-κB信號通路的機制已成為目前該科病毒屬研究的方向，將為進一步闡明NF-κB信號通路對病毒感染的反應、識別該途徑的關鍵環節，從而開發針對該靶點潛在的治療藥物，以及疫苗候選株的培育提供科學依據。