小型豬在人類疾病模型方面的研究進展

吳華莉，涂尾龍，曹建國，王洪洋，范 春，王勝昌，趙 瑩，談永松

（1.上海市農業科學院畜牧獸醫研究所，上海 閔行 201106；2.上海市種豬工程技術研究中心，上海 浦東 201302；3.上海實驗動物研究中心，上海 浦東 201302）

隨著人類疾病研究的不斷發展，對實驗動物的需求越來越大，不僅對常用的小鼠和大鼠的數量增加，對其他動物如兔、犬等實驗動物的數量也在增加。然而這些實驗動物和人在生理特征和基因表達等方面有所不同，不能充分模擬人類疾病，而豬由于在解剖學、神經生物學、心臟血管系統、胃腸道和基因組等方面更接近人類，是理想的人類疾病模型[1-3]。豬作為一種動物模型能夠為分子生物化學研究提供足夠的組織和血液，而且豬的壽命長可以詳細跟蹤疾病的進展。例如Baxa等對小型豬的亨廷頓氏病模型進行系列研究時間長度達到8年，這在其他實驗動物身上是不可能的[4]。科研工作者以小型豬為醫學實驗動物模型進行大量研究，尤其作為人類疾病研究的動物模型近年來得到很大發展。

1 用于人類疾病模型的小型豬品種

國內用于人類疾病模型的小型豬品種有廣西巴馬小型豬、貴州小型豬、五指山小型豬近交系和西藏小型豬等[5-6]。國外用于人類疾病模型的小型豬品種有哥廷根系（Goottingen）、尤卡坦系（Yucatan）、明尼蘇達-荷曼小型豬（Minnesota-Hormel）、皮特曼-摩爾小型豬（Pitman-Moore）、科西嘉小型豬（Corsica）和漢佛特小型豬（Hanford）等[7-9]。

2 小型豬在人類疾病模型研究的進展情況

2.1 在心血管疾病模型方面

豬被認為是人類心血管系統的理想實驗動物模型，因為豬的心臟形態、功能、血流動力學和代謝方面與人類相似[10-11]。研究者采用基因修飾技術構建人心血管疾病轉基因豬模型，包括內皮一氧化氮合酶（eNOS）轉基因豬、過氧化氫酶（hCat）轉基因豬、載脂蛋白CIII（ApoCIII）轉基因豬和過氧化物酶體復合物-γ（PPAR-γ）基因敲除豬。Hao等采用尤卡坦小型豬生產eNOS轉基因豬。血管功能、血管結構和穩態部分受內皮細胞eNOS釋放的一氧化氮（NO）調控，在機體健康和疾病中，eNOS釋放的NO在調節骨骼和心肌代謝中發揮重要作用。轉基因豬的eNOS基因由一個Tie-2啟動子驅動，并標記V5 His標簽，目的在于了解eNOS對心血管的調節作用[12]。Whyte等以內皮特異性方式過表達hCat，培育轉基因尤卡坦小型豬，目的在于研究過氧化氫（H2O2）在血管健康和疾病機制中發揮的作用。hCat代謝H2O2，H2O2是血管緊張度的重要調節因子，可導致動脈粥樣硬化和子癇前期等疾病[13]。Wei等報道ApoCIII轉基因小型豬模型的產生，以研究高脂血癥與動脈粥樣硬化疾病的關系。高甘油三酯血癥被認為是冠心病的獨立危險因素，心血管疾病與脂蛋白代謝密切相關，ApoCIII與血漿甘油三酯水平密切相關。在轉基因豬中，發現血漿甘油三酯水平升高，血漿甘油三酯清除延遲，脂蛋白脂肪酶活性降低[14]。Yang等報道，生產PPAR-γ基因敲除豬，PPAR-γ在心血管疾病中起重要作用。PPAR-γ激動劑噻唑烷二酮類（TZDs）是臨床應用于治療2型糖尿病的胰島素增感劑。生產小型豬模型目的在于研究PPAR-γ和TZDs在糖尿病和心血管并發癥中的功能[15]。陳民利等建立了小型豬慢性心肌缺血模型，對五指山豬、巴馬小型豬和西藏小型豬的運輸應激和高脂誘導發生動脈粥樣硬化（AS）的危險因素進行評估[16]。小型豬慢性心肌缺血模型，對于心臟疾病的研究與治療方面具有重要意義[17-18]。五指山小型豬被用于構建急慢性心肌缺血模型、致急性心肌梗死模型、心力衰竭模型和心肺復蘇后心肌代謝評估等疾病模型[19]。

2.2 亨廷頓氏病模型

亨廷頓氏病（Huntington's disease, HD）是一種遺傳性毀滅性的神經退行性疾病[20]。目前尚無治愈方法，治療HD的方法在臨床應用之前需要對其安全性、耐受性和有效性進行測試。由于編碼亨廷頓（Huntingtin, Htt）蛋白的基因突變引起胞嘧啶、腺嘌呤和鳥嘌呤序列重復擴增，導致Htt蛋白氨基端的多聚谷氨酰胺膨脹和突變蛋白積累。具有致病性鳥嘌呤序列重復次數與疾病的嚴重程度和發病年齡密切相關。這種疾病具備單遺傳性質，從而使生產攜帶突變亨廷頓蛋白（the mutated huntingtin, mHTT）的轉基因動物模型成為可能[21]。Baxa等生產表達人亨廷頓蛋白的N端區域的轉基因亨廷頓病小型豬（transgenic HD minipig boars, TgHD）[22]。突變亨廷頓蛋白（mtHtt）不僅導致大腦神經元變性，也會影響生殖系統。Macakova等對F1代（24～48月齡）和F2代（12～36月齡）轉基因小型豬（TgHD）和野生型（WT）的小型豬精子和睪丸的生殖細胞學參數和電鏡圖像進行比較，結果發現24月齡和36月齡TgHD公豬的精子尾部和睪丸上皮細胞中有許多病理特征，睪丸中精原細胞的增殖活性顯著降低。mtHtt在TgHD公豬精子和睪丸中高表達，并定位于所有輸精管細胞中，研究結果證實TgHD公豬的精子和睪丸變性是由高表達的mtHtt功能獲得引起的[23]。Askeland等檢測48月齡TgHD豬線粒體DNA損傷和代謝改變的標記物[21]。Ardan等在TgHD豬5～5.8歲時，檢測HD 的病理特征，在新紋狀體和大腦皮質以及一些神經元軸突中檢測到基因型特異性的顯著細胞丟失[24]。Baxa等檢測8歲前TgHD豬的運動、認知和行為表型，建立新的測試方法調查TgHD豬的身體活動，并探索其在壓力誘導下的行為和認知變化。結果顯示了6～8歲的TgHD豬和野生型豬之間的顯著差異，與野生型野豬相比，4.6～6.5歲的TgHD公豬在午餐期間和下午的體力活動都有所增加[4]。基于小型豬建立亨廷頓氏病模型研究的結果，美國食品和藥物管理局和歐洲藥品評估機構批準其用于第一期和第二期臨床試驗。研究者生產TgHD的意義在于通過大型動物模型反映人類疾病進展情況，從而有助于測試潛在治療HD的方法和縮短患者治療的時間。

2.3 侏儒病模型

骨的生長主要受生長激素（GH）和胰島素樣生長因子I（GH-IGF-I）軸調控，豬的GH-IGF-I軸與人類有許多相似之處[25]。在胚胎發育過程中，囊胚的形成和上肢芽的出現等關鍵事件在豬和人的妊娠期同時發生，豬的生長曲線與人相似[26]。豬骨質代謝方面與人有諸多相似，為研究生長激素受體 （GHR）缺陷對人原發性生長激素不敏感綜合征（Laron）對骨生長和代謝的影響提供了更好的模型。Cui等利用鋅指核酸酶（ZFNs）敲除GHR基因，獲得了3種F0雜合子豬（GHR+/4 bp、GHR+/2 bp、GHR+/3 bp），將雜合子豬培育成純合子（GHR4 bp/4 bp）豬，其體形小，體重減輕。從生物化學角度看，這些豬表現出明顯的GH水平升高和IGF-I水平降低，這些結果與在Laron患者身上觀察到的表型相似，提示這些豬可以作為Laron綜合征疾病的研究模型[27]。

2.4 癌癥模型

2.4.1 乳腺癌模型 乳腺癌相關基因1（BRCA1）變異與乳腺癌發生、發展和治療密切相關[28]。BRCA1是腫瘤抑制因子，在DNA斷裂的同源修復中發揮重要作用。BRCA1的突變導致基因組不穩定和癌癥易感性[29-30]。年輕人的乳腺癌與BRCA1基因的突變有關[31]。Luo等培育出敲除BRCA1等位基因的尤卡坦小型仔豬，然而所有的小豬在出生后18天內死亡，這些豬早期死亡的原因仍不清楚[32]。

2.4.2 結直腸癌模型 結直腸癌（Colorectal cancer, CRC）是全球第三大常見人類癌癥，也是截至2018年癌癥相關死亡的第二大原因[33]。并且結直腸癌發病率呈現年輕化趨勢[34-35]。結直腸癌起源于結腸和直腸的上皮襯里，抑制腫瘤的腺瘤樣結腸息肉蛋白（adenomatous polyposis coil, APC）的功能破壞是引發腺瘤性息肉形成的主要事件，APC作為Wnt通路的負調控因子，丟失或功能障礙導致Wnt信號異常，從而導致增殖和腫瘤形成的增加[36-37]。已經產生攜帶內源性豬APC基因1311位（APC1311）翻譯停止密碼子的豬，該密碼子與導致嚴重家族腺瘤性息肉病（familial adenomatous polyposis, FAP）的人類APC1309突變同源。APC1311/+豬在1年內出現結腸和直腸息肉，表現為典型的人類腺瘤癌序列，如異常隱窩病灶、高級別瘤變和原位癌等。豬腺瘤表現出人類FAP和散發性CRC的遺傳和生化特征。從APC1311這樣的單一突變啟動癌前腫瘤的一個重要優勢是可以詳細跟蹤導致癌癥的后續自發事件，這在老鼠身上是不可能的[38]。

2.5 色素性視網膜炎（Retinitis pigmentosa, RP）模型

色素性視網膜炎（RP）的特征是光感受器最初的進行性喪失、隨后血管和其他細胞層惡化，是一種遺傳性、致盲性視網膜疾病[39]。RP患者由于視網膜色素上皮細胞功能逐漸喪失及光感受器進行性凋亡從而導致不可逆的視力損傷。RP小鼠模型由于小鼠和人類之間眼球細胞結構差異，不能完全復制這種疾病。人與鼠眼球的主要區別在于視網膜上感光細胞的數量和分布，尤其是視錐感光細胞，人的視網膜比嚙齒動物的視網膜有更多的視錐感光細胞，人眼視網膜的視錐感光細胞主要分布在黃斑區晚期。然而在嚙齒類動物的視網膜中，這些細胞均勻地分布在整個視網膜上[40]。豬的視網膜有一個黃斑區域，富含視錐感光細胞，類似于人類的視網膜。豬是再生醫學臨床研究的理想對象，因為它的眼睛在大小和結構上與人的眼睛相似，外圍主要是桿狀光感受器，而視覺條紋主要是錐狀光感受器，因此，豬是比鼠更好的RP模型。Petters等生產表達突變的視紫紅質基因Pro347Leu突變的轉基因豬，早期時出現嚴重的桿狀光感受器丟失，最初它們的視錐光感受器相對存活，但這些幸存的視錐光感受器慢慢退化，當轉基因豬發育到20個月齡時，只有一層形態異常的視錐光感受器，視錐細胞視網膜電圖明顯減少[41]。Ross等生產表達人視紫紅質P23H突變的轉基因豬模型，這些轉基因豬在3個月后出現異常暗視和明視的視網膜電圖。豬RP模型的這種表型與RP患者的表型相似，為研究RP的發病機制和治療方法提供了新的工具[42]。

2.6 囊性纖維化病模型

囊性纖維化病（cystic fibrosis, CF）是一種常染色體隱性遺傳病，是由編碼囊性纖維化跨膜傳導調節因子（cystic fibrosis transmembrane conductance, CFTR）的基因突變引起的[43]。CF影響多個器官，如胰腺、腸、肝、輸精管和肺。肺疾病是導致CF發病和死亡的主要原因。豬的肺與人類相似，已被建立為幾種人類肺部疾病狀態的模型。Welsh等生產的新生CFTR-/-仔豬表現出腸道病變、胰腺破壞、膽囊異常和早期肝硬化，與人類CF中觀察到的情況相似。隨著時間的推移，CFTR-/-豬出現了人類CF中肺部疾病的標志性特征。CFTR-/-豬模型復制了人類CF的大部分特征，提示這些CFTR-/-豬對更好地理解CF的發病機制以及開發新的治療方案具有價值[44]。

3 展望

目前小型豬已有多種用于人類疾病的轉基因豬模型問世。與小鼠相比，可用來復制人類疾病的豬模型數量有限。造成這種情況的原因有很多，如成本高、懷孕時間長和性成熟。此外豬的技術方面極大地限制了轉基因豬模型的生產。因此，到目前為止，只有少數基因敲除豬模型被實現。鑒于特異性基因修飾新技術的出現，如ZFN、轉錄激活子樣效應因子核酸酶（Transcription activator-like effector nucleases, TALEN）、具有長期增殖能力的供體細胞、豬的誘導多能干細胞等，這些新技術使豬的基因修飾比以往更加有效。此外功能基因組學和蛋白質組學有助于分析豬模型在人類疾病模型的生物學和病理學復雜的分子機制。特別是基因組、轉錄和蛋白質組數據的整合產生的“系統生物學”促進實驗動物模型快速發展。未來需要建立實驗用小型豬標準化實驗室，包括遺傳學、實驗動物管理學，以及實驗的標準化技術和設備。隨著特定基因修飾技術和實驗室豬標準化技術的進步，不久的將來會產生更多用于人類疾病的豬模型，從而促進人類疾病臨床研究和轉化醫學的發展。