白花香蓮解毒顆粒促進慢性乙型肝炎HBeAg血清學轉換及對血清Furin表達的臨床研究

李旺，邱華，蒙蔭杰，呂超，舒發明，李媛，毛德文

(1.廣西中醫藥大學，廣西 南寧 530001； 2.廣西中醫藥大學第一附屬醫院，廣西 南寧 530023)

抗病毒是慢性乙型肝炎(Chronic hepatitis B，CHB)治療的關鍵，根據病毒學與血清學的應答結果，可分為基礎終點、滿意終點及理想終點3個階段。循證數據顯示，對于HBeAg陽性的CHB而言，達到HBeAg血清轉換預示著更低的復發率，更短的療程及更少的經濟負擔[1]。而目前核苷(酸)類似物、干擾素等抗病毒藥物在實現理想目標即HBsAg血清學轉換、滿意目標即HBeAg血清學轉換方面均尚未取得預期療效。因此，深入探索HBeAg血清學轉換的分子機制，構建有效的干預新途徑，提高血清學轉換率是當前乙肝抗病毒領域國際最前沿方向及技術爭奪的制高點。弗林蛋白酶(Furin)是一種重要的內切蛋白酶，屬于前蛋白轉化酶家族成員。研究發現，Furin通過對HBeAg前體的切割，參與到HBeAg的成熟過程[2]，而未切割的HBeAg可以被轉運到細胞外膜上從而觸發抗病毒免疫反應[3]。本課題組前期臨床及體外實驗均證實白花香蓮解毒顆粒具有促進HBeAg和HBsAg血清學轉換的療效，但是其機制尚未明確[4]。本研究擬通過觀察白花香蓮解毒顆粒對HBeAg陽性CHB患者血清HBeAg及Furin表達的影響，以揭示其促進HBeAg血清學轉換的機制。

1 資料與方法

1.1 一般資料

在2018年7月—2019年6月期間，收集120例在廣西中醫藥大學第一附屬醫院肝病科就診的HBeAg陽性CHB患者和20例健康人。將120例HBeAg陽性CHB患者隨機分為對照組和治療組，各60例。其中對照組男性33例，女性27例，平均年齡(33.24±10.78)歲，HBV DNA載量(6.62±0.63)lg IU/mL，血清中HBeAg滴度(884.76±479.52)S/Co；治療組男性36例，女性24例，平均年齡(35.42±9.88)歲，HBV DNA載量(6.43±0.89)lg IU/mL，血清中HBeAg滴度(926.76±513.18)S/Co。兩組患者性別、平均年齡、HBV DNA載量、HBeAg滴度等基線資料比較，差異無統計學意義(P>0.05)。同時招募20例健康人作為健康對照組，其中男、女人數各10例，平均年齡(30.15±4.38)歲。該研究通過廣西中醫藥大學第一附屬醫院倫理委員會的審批，且參與研究的所有受試者都簽訂了知情同意書。

1.2 診斷標準

HBeAg陽性CHB診斷標準：參照《慢性乙型肝炎防治指南(2015)》[5]中的診斷標準,血清HBsAg、HBeAg均為陽性，HBV DNA陽性，ALT持續或反復異常或肝組織學檢查有炎癥變化。

1.3 納入及排除標準

納入標準：①符合HBeAg陽性CHB診斷標準[5]；②HBV DNA≥2×105，ALT≥2×ULN；③年齡18～65歲；④簽署知情同意書。

排除標準：①合并其他肝炎病毒，如甲、丙、丁、戊型肝炎；②有艾滋病、肺結核及梅毒等嚴重傳染病者；③合并肝細胞癌、肝性腦病及其他嚴重的全身性疾病和精神病患者；④孕婦或哺乳期婦女；⑤對中藥過敏者。

1.4 治療方法

對照組：給予恩替卡韋分散片(規格型號：0.5 mg×28片，正大天晴藥業集團股份有限公司，批準文號：國藥準字H20100019)0.5 mg/次，1次/d，定時空腹口服(餐前或餐后至少2 h)，療程48周。

治療組：在對照組的基礎上加白花香蓮解毒顆粒[6],主要成分為白花蛇舌草30 g，三葉香茶菜20 g，黃花倒水蓮15 g，排錢草15 g，14 g/袋，由廣西中醫藥大學第一附屬醫院院內制劑中心統一制備,1袋/次，2次/d，早晚飯后沖服，療程48周。

1.5 觀察指標及檢測方法

血清中Furin、HBeAg的測定：清晨空腹抽取靜脈血5 mL于真空采血管中，將試管樣本放置4 ℃ 3 000 r/min離心20 min，仔細取上清液，將血清樣品儲存在-80 ℃冰箱。使用酶聯免疫吸附法測定血清中Furin、HBeAg水平，結果均以pg/mL表示。檢測過程嚴格按照試劑盒說明書進行，質控均在范圍內。HBV DNA載量的測定：采用熒光定量PCR法檢測血清HBV DNA載量。

1.6 統計學方法

2 結果

2.1 治療前后各組DNA HBV載量的比較，見表1。

表1 治療前后兩組CHB患者HBV DNA載量的比較

治療前，兩組患者血清中HBV DNA載量對比，差異無統計學意義(P>0.05)；在12周、24周、48周，兩組患者血清中HBV DNA載量較前均低于治療前，差異有統計學意義(P<0.05)。兩組同時間段比較：治療12、24周后，治療組HBV DNA載量均低于對照組，差異有統計學意義(P<0.05)，治療48周后，兩組HBV DNA載量相比，差異無統計學意義(P>0.05)。

2.2 兩組HBeAg血清學轉換比率和HBeAg轉陰比率的比較

治療48周，治療組HBeAg血清學轉換和HBeAg轉陰率明顯高于對照組(P<0.05)，見表2。

表2 兩組CHB患者HBeA血清轉換比率和HBeAg轉陰比率的比較[例(%)]

2.3 兩組HBeAg滴度水平的比較

治療12周、24周、48周，治療組的HBeAg滴度顯著低于對照組(P<0.05)，見表3。

表3 兩組CHB患者HBeAg滴度水平的比較

2.4 治療前后各組血清中Furin含量的比較

治療前，兩組患者血清中Furin含量比較，差異無統計學意義(P>0.05)，兩組患者與健康對照組比較，差異有統計學意義(P<0.05)；治療組在治療12、24、48周時，Furin的含量均低于治療前，且在24周、48周，治療組Furin含量均低于對照組，差異有統計學意義(P<0.05)；對照組在治療24周、48周后，血清中Furin含量與治療前相比，差異有統計學意義(P<0.05)，見表4。

表4 治療前后各組血清中Furin含量

2.5 不良反應記錄

治療前后，兩組患者的血常規、腎功能及心電圖均未見明顯改變，治療組出現1例腹瀉癥狀，予蒙石脫散后，癥狀緩解，之后未出現嚴重不良事件。

3 討論

臨床上CHB患者，根據HBeAg陽性和陰性表達不同可分為HBeAg陽性CHB、HBeAg陰性CHB，前者由野生型毒株引起發病，占CHB患者人群的大部分。研究表明，HBeAg陽性代表著HBV病毒復制活躍，進展為肝硬化、肝衰竭及肝癌等重癥肝病的風險更大[7]。而HBeAg血清學轉換(HBeAg Conversion，HC)，即血清中HBeAg消失，同時出現能夠識別HBeAg的T細胞依賴性中和抗體(e抗體)，其后期因HBV相關的肝衰竭、肝硬化和HCC發生率明顯減少，且停藥后出現病毒學、生化學和組織學突破者顯著下降，被認為是抗病毒過程中的標志性轉折點。目前抗病毒藥有核苷(酸)類似物和干擾素，它們在抑制HBV DNA復制等方面已經取得較好的療效，但是在促進HBeAg血清學轉換這一更具臨床價值、更迫在眉睫的問題尚不夠理想。如恩替卡韋其治療48周HBeAg血清學轉換率僅為21%，3年為24%；替諾福韋治療48周HBeAg血清學轉換率為21%，替比夫定治療48周其HBeAg血清轉化率為25%～28%，3年可達42%。即使聚乙二醇干擾素也只能使30%～40%的HBeAg陽性CHB患者發生HBeAg血清學轉換[8]。從上述數據不難看出，要實現大部分乙肝患者抗病毒治療均能達到滿意目標及理想目標仍然任重而道遠。因此，深入探索HBeAg血清學轉換的分子機制，構建有效的干預新途徑，提高血清學轉換率是當前乙肝抗病毒領域國際最前沿方向及技術爭奪的制高點。其中Furin作為真核生物細胞中一種重要的內切蛋白酶，其通過識別特定的氨基酸序列，特異性切割前蛋白中成對的堿性氨基酸，使前體蛋白獲得生物活性，對維持細胞內環境穩定和誘發多種疾病均起重要的作用[9]。Furin對HBeAg前體成熟為HBeAg發揮至關重要作用。HBeAg前體在經過高爾基體時，需被人蛋白酶Furin切去氨基端的34個氨基酸殘基才能產生成熟的HBeAg蛋白，分泌到細胞外，進而誘導免疫耐受而參與慢性HBV感染狀態的形成和維持[10]，YANG[11]等研究表明恩替卡韋聯合Furin蛋白抑制劑能顯著地減少HBV復制和HBeAg生成，這結論進一步證實下調Furin蛋白的表達會減少HBeAg的生成，有利于促進HBeAg血清學轉換。以Furin蛋白為靶點的促HBeAg血清學轉換研究日益受到關注。

中醫藥是治療CHB的一種重要手段，其在保肝降酶、抗肝纖維化、調節免疫及抗病毒等方面具有較好的療效。我國“十一五”“十二五”多項科技重大傳染病專項從循證醫學層面證實，中醫藥確能提高HBeAg陽性慢性乙型肝炎或攜帶者的HBeAg血清學轉換率，這為破解目前HBV抗病毒治療低HBeAg、HBsAg血清學轉換率的難題提供了一種切實可行的新途徑。有學者[12]研究表明中藥聯合阿德福韋治療HBeAg陽性CHB患者48 W時，HBeAg應答率為29.64%，對照組為17.86%，提高HBeAg應答率11.78%，差異具有統計學意義(P<0.05)；還有研究[13]表明補腎健脾方治療HBeAg陽性HBV攜帶者52 W時，治療組患者HBeAg均值、HBsAg均值下降均顯著優于安慰劑對照組，差異具有統計學意義(P<0.05)。

白花香蓮解毒顆粒[14]是在壯醫“陰陽為本，三氣同步”天人自然觀、“谷道水道氣道、龍路火路，三道兩路通調”生理病理觀和“虛毒致百病”病因病機觀等核心理論指導下形成的。當機體正氣虛(出現慢性乙型肝炎)，毒邪外侵，藏于咪疊(肝臟)，疏泄失司，蘊生諸毒，噓勒(氣血)瘀滯，致“三道”“兩路”阻塞，使“三氣”(天氣、地氣、人氣)不能同步，共而為病的病機理論。白花香蓮解毒顆粒是本課題組研制的治療慢性乙型肝炎的有效藥物。前期臨床研究表明，白花香蓮解毒顆粒聯合阿德福韋酯膠囊治療HBeAg陽性CHB患者，能顯著提高了HBV DNA 轉陰率、生化應答率及HBeAg血清學轉換率[15-16]。

本研究結果顯示，治療12、24、48周時，兩組患者血清HBV DNA載量均較治療前顯著下降，差異有統計學意義(P<0.05)。其中治療12、24周，對照組血清中HBV DNA載量低于對照組，差異有統計學意義(P<0.05)。治療48周，對照組HBeAg血清學轉換和HBeAg轉陰率均高于對照組，差異有統計學意義(P<0.05)。治療24、48周，對照組血清Furin表達量均低于對照組，差異有統計學意義(P<0.05)。

綜上所述，白花香蓮解毒顆粒聯合恩替卡韋的方案，能顯著提高達到滿意終點的HBeAg血清學轉換率，其機制可能與下調Furin表達有關，具有一定的臨床推廣應用價值。