齊墩果酸誘導肝癌細胞凋亡的實驗研究

孫陽，孫悅，吳勃巖，陶雪蓮，姜德友

(黑龍江中醫藥大學，黑龍江 哈爾濱 150040)

齊墩果酸(Oleanolic Acid,OA)是五環三萜類化合物，它是一種天然化學成分，存在于多種植物藥物中[1-3]。中藥復方貞術消積湯，由女貞子、夏枯草、白花蛇舌草、莪術和甘草組成，其中君藥女貞子、臣藥白花蛇舌草和夏枯草均含有齊墩果酸。課題組研究證實該復方對肝癌有抑制作用[4]。文獻報道，齊墩果酸可以抑制HepG2肝癌、結腸腺癌、膀胱癌、卵巢癌、肺癌等細胞增殖、轉移，誘導細胞凋亡和自噬發揮抗腫瘤作用[5-8]。課題組前期也開展了齊墩果酸在體實驗，發現藥物抑制H22肝癌細胞增殖，通過線粒體途徑誘導細胞凋亡[9]，但由于齊墩果酸不溶于水和油，限制了藥物吸收和生物利用度,本實驗制備齊墩果酸自微乳開展離體實驗研究。

1 實驗材料

1.1 細胞株

人肝癌SMMC-7721細胞購于武漢博士德生物公司(編號：CX0296)。

1.2 藥品與試劑

齊墩果酸(美倫生物公司，編號：MB6817)、順鉑(Sigma公司，編號:MKBV3446V)；蓖麻油(阿拉丁試劑公司，編號：8001-79-4)、吐溫80(天津市富宇精細化工有限公司，批號：20140901)、蓖麻油聚氧乙烯醚(麥克林公司，編號：61791-12-6)、PEG400(天津市光復精細化工研究所，批號:20131112)、 四甲基偶氮唑藍(MTT，Sigma公司，編號：M-2128)；AnnexinⅤ-FITC細胞凋亡檢測試劑盒(碧云天公司，編號：C1062)；Bcl-2、Bax和GAPDH抗體(Abcam公司，編號分別為ab182858、ab32503和ab128915)，p-Akt(Ser473)和Akt抗體(CST, 編號為9272和4060)。

1.3 主要實驗儀器

Multiskan MK3酶標儀、BDAira流式細胞儀、EVOS FL Auto倒置熒光顯微鏡、Wiggens磁力攪拌器、MX3000P Real-time PCR儀。

2 實驗方法

2.1 制備齊墩果酸自微乳

齊墩果酸(OA)與蓖麻油、吐溫80、蓖麻油聚氧乙烯醚、PEG400(20:16:34:30)混合，OA的濃度為30 mg·g-1。將其置于50 ℃水浴中溫和攪拌直至藥物完全溶解，呈白色黏稠液體；同時制備無齊墩果酸的空白自微乳。分別取二者加蒸餾水稀釋制成白色和無色透明微乳液，放置于4 ℃冰箱，2日后觀察無雜質析出,將制備的微乳液濾菌，4 ℃保存備用。

2.2 細胞培養

SMMC-7721細胞用含10%胎牛血清的RPMI1640完全培養基，于5%CO2、37 ℃培養箱中常規培養。細胞密度達到80%時，0.25%胰酶消化，1∶3傳代，取對數生長期細胞用于后續實驗。

2.3 細胞分組及給藥

實驗細胞分為模型對照組、齊墩果酸組和順鉑組。藥物與完全培養液混合，齊墩果酸和順鉑的終濃度分別為80 μg·mL-1和15 μg·mL-1，作用時間均為24 h。

2.4 MTT實驗

將對數生長期的肝癌細胞消化成單細胞懸液接種于96孔板，每孔接種密度為5×104個，模型對照組加入完全培養液培養(無齊墩果酸)，實驗組分別加入20、40、60、80、100、120、140、160、180 μg·mL-1齊墩果酸自微乳，空白對照組加入空白自微乳培養液，培養24 h后每孔加入20 μL MTT，繼續培養4 h后棄上清，每孔加入100 μL DMSO，振蕩搖勻后，于波長570 nm處讀取OD值。細胞存活率=(實驗組OD-調零組OD)/(模型對照組OD-調零組OD)×100%，每組設定5個重復孔，計算平均值。

2.5 細胞培養液中IL-6含量的測定

Elisa法檢測IL-6含量。收集各組細胞培養液上清，離心去除沉淀等雜質，按照試劑盒說明書進行操作。每次檢測均做標準曲線，根據樣品的吸光度值在坐標上找到對應的濃度。

2.6 熒光顯微鏡觀察細胞形態

肝癌細胞接種于6孔板中，將80 μg·mL-1齊墩果酸和15 μg·mL-1順鉑處理細胞24 h，用AnnextinV-FITC/PI雙染細胞凋亡試劑盒染色，室溫下避光作用10 min，熒光顯微鏡下觀察，AnnexinV-FITC染色陽性細胞呈綠色熒光，PI染色陽性細胞呈紅色熒光，未被熒光染色的是正常細胞，僅為綠色熒光的是早期凋亡細胞，紅、綠色熒光雙染的是晚期凋亡或壞死細胞。

2.7 流式細胞術檢測肝癌細胞凋亡

將齊墩果酸和順鉑作用于6孔板中的肝癌細胞，24 h后PBS沖洗、胰酶消化收集細胞，用AnnextinV-FITC/PI雙染細胞凋亡試劑盒染色，流式細胞儀檢測各組熒光強度，FACSDiva Version6.1軟件分析，比較各組總凋亡率、早期凋亡率和晚期凋亡率。

2.8 細胞Bax、Bcl-2和Akt mRNA表達

收集各組細胞，提取RNA，瓊脂糖凝膠電泳法分析其完整度。各基因引物分別為：Bax 上游5′-CCCTTTTCTACTTTGCCAGCA-3′，下游5′-GGAGTCTCACCCAACCACCC-3′，150 bp;Bcl-2上游5′-CCCTGTGGATGACTG AGTACCTG-3′，下游5′-GCCGTACAGTTCCACAAAGGC-3′，89 bp;Akt上游5′-ACCTTCCATGTGGAGACTCCTGAG-3′，下游5′-GTCCATCTCCTCCTCCTCCTGC-3′，99 bp;GAPDH上游5′-CATGAGAAGTATGACAACAGCCT-3′，下游5′-AGTCCTT CCACGATACCAAAGT-3′，113 bp。

2.9 Bax、Bcl-2、Akt和p-Akt蛋白表達

收集各組細胞，蛋白裂解液作用后收集上清，測定蛋白濃度。取蛋白20 μg加入上樣緩沖液，95 ℃條件下變性10 min。經過凝膠電泳、轉膜、封閉、加入Bax、Bcl-2、Akt(抗體濃度1∶1 000)、p-Akt(抗體濃度1∶300)，GAPDH(抗體使用濃度1∶10 000)，4 ℃孵育過夜，加入二抗后孵育顯影檢測、分析,重復3次。

2.10 統計分析

3 實驗結果

3.1 齊墩果酸對肝癌細胞增殖的影響

空白對照組和齊墩果酸組油劑均為透明微黃的油狀液體，將兩種乳化劑加水稀釋后發現，空白對照組溶液顏色透明并有藍色乳光，齊墩果酸自微乳水溶液為白色均一液體。空白對照組與模型對照組細胞存活率比較，差異無統計學意義(P>0.05)，說明制備自微乳的輔料對細胞的增殖沒有影響。不同劑量的齊墩果酸作用肝癌細胞24 h，細胞存活率與模型對照組相比，具有統計學意義(P<0.05)，隨著濃度的增加，細胞的存活率降低，如表1所示。根據細胞增殖實驗結果，后續實驗齊墩果酸劑量為80 μg·mL-1。

表1 齊墩果酸對肝癌細胞存活率的影響

3.2 齊墩果酸對肝癌細胞IL-6的影響

根據標準曲線公式Y=0.008X+0.143(R2=0.953)，X為IL-6濃度，Y為吸光度，計算各組IL-6的含量(如表2所示)。齊墩果酸和順鉑組IL-6含量均低于模型對照組，差異有統計學意義(P<0.05)。與順鉑組相比，齊墩果酸組略低，但無統計學意義(P>0.05)；結果說明，齊墩果酸和順鉑抑制肝癌細胞中IL-6的產生。

表2 齊墩果酸對肝癌細胞IL-6的含量的影響

3.3 熒光顯微鏡下觀察齊墩果酸誘導細胞凋亡

AnnexinV-FITC/PI雙標法熒光顯微鏡觀察，其中綠色熒光為AnnexinV-FITC染色陽性細胞，僅被綠色熒光染色為凋亡細胞，未被熒光染色為正常細胞，綠色和紅色均染色的細胞為晚期凋亡細胞。圖1可見模型對照組細胞正常細胞數量較多，凋亡細胞的數量相對較少。齊墩果酸組和順鉑組凋亡細胞較模型對照組數量明顯增加，正常細胞數量相對減少。

圖1 熒光顯微鏡觀察肝癌細胞形態(100×)

3.4 流式細胞術檢測齊墩果酸誘導細胞凋亡

如表3和圖2所示，與模型對照組比較，齊墩果酸和順鉑組的晚期凋亡(Q2)率、早期凋亡(Q4)率和總凋亡率明顯增加，差異顯著(P<0.05)；齊墩果酸與順鉑組比較，各指標均低于順鉑組，差異顯著(P<0.05)。

圖2 齊墩果酸對肝癌細胞凋亡的影響

表3 齊墩果酸對肝癌細胞凋亡率的影響

3.5 細胞Bax、Bcl-2和Akt mRNA表達

各組細胞藥物作用24 h后，與模型對照組(2-ΔΔCt=1)相比，用藥組Bax mRNA表達明顯上調(P<0.05)，順鉑組與齊墩果酸組Bax mRNA差異不顯著(P>0.05)；Bcl-2 和Akt mRNA 表達下調(P<0.05)，順鉑組與齊墩果酸組比較差異有統計學意義(P<0.05)，齊墩果酸對Bcl-2 mRNA表達的抑制作用強于順鉑，如表4所示。

表4 齊墩果酸對肝癌細胞Bax、Bcl-2和Akt mRNA相對表達

3.6 細胞Bax、Bcl-2和Akt蛋白表達

各組細胞Bax、Bcl-2、Akt和p-Akt蛋白表達檢測結果如圖4，表5所示。與模型對照組比較，用藥組Bax蛋白表達上調(P<0.05)，順鉑與齊墩果酸比較，有統計學意義(P<0.05)；與模型對照組相比，用藥組Bcl-2蛋白表達下調(P<0.05)，齊墩果酸組低于順鉑(P<0.05)；齊墩果酸和順鉑組Akt和p-Akt蛋白表達下調，與模型對照組相比有統計學意義(P<0.05)；順鉑組Akt和p-Akt蛋白表達低于與齊墩果酸組，有統計學意義(P<0.05)。

圖4 齊墩果酸對Bax、Bcl-2、Akt 和p-Akt蛋白表達的影響

表5 齊墩果酸對肝癌細胞Bax、Bcl-2、Akt和p-Akt蛋白表達的影響

4 討論

肝癌屬于“癥瘕”“積聚”等范疇，病機為本虛標實，本虛是正氣虧虛，標實為氣滯、痰濁、濕毒、血瘀相互為患，蘊結于肝致使發病。中醫藥多以扶正固本、抑癌攻毒為治法，對控制腫瘤發展起重要作用。課題組前期研究的中藥女貞子歸肝、腎經，屬于補益類中藥，具有扶正固本作用，并且具有免疫調節作用。女貞子的有效成分齊墩果酸，在本實驗中發現通過影響IL-6細胞因子，發揮抗腫瘤作用。IL-6是由淋巴樣和非淋巴樣細胞產生的細胞因子，對淋巴細胞、造血干細胞、肝細胞等均有生物學效應。IL-6參與肝癌的發生、發展，因此抑制其生成具有重要的意義。IL-6通過激活酪氨酸蛋白激酶-信號傳導和轉錄激活因子(janus kinase-signal transducers and activators of transcription,JAK-STAT)及磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B(phosphatidylinositol-3-kinase/proteinkinase B,PI3K/Akt)信號通路發揮抑制凋亡的作用[10-12]。齊墩果酸和陽性對照藥順鉑均可抑制IL-6產生及Akt基因和蛋白表達，通過抑制該信號通路及其下游基因的表達，誘導細胞凋亡。B細胞淋巴瘤-2(Bcl-2)和Bcl-2相關X蛋白(Bax)屬于Bcl-2家族成員，彼此相互作用調節細胞的存活與凋亡。Bcl-2和Bax 與線粒體途徑的細胞凋亡關系密切。Bcl-2通過調節線粒體膜電位、膜通透性，抑制半胱天冬酶活性，結合細胞色素C，抑制細胞凋亡。Bax接收到各種凋亡信號后，在線粒體膜上形成釋放凋亡因子的孔道，促進線粒體膜通透化(MOMP)，細胞色素C釋放，啟動細胞凋亡。據報道，多種中藥和其有效成分可通過調控Bcl-2家族基因的表達，誘導細胞凋亡或自噬，發揮抗腫瘤的作用[13-14]，亦可負調控，避免細胞凋亡性死亡，起到保護細胞的作用[15]。本實驗發現齊墩果酸對肝癌細胞有抑制作用，通過上調Bax基因表達，下調Bcl-2基因表達，誘導細胞發生凋亡。齊墩果酸誘導肝癌細胞凋亡率低于順鉑組，下調Akt基因表達作用弱于順鉑，下調Bcl-2基因表達作用強于順鉑，說明藥物抗腫瘤的作用靶點多種，順鉑誘導細胞凋亡還有其他的途徑和信號通路，各信號通路之間交叉串話，今后課題組將深入研究藥物抗腫瘤的其他分子機制。