UPLC-MS/MS法同時測定狗皮膏中2種大黃蒽醌類成分含量的研究

劉紫衡，呂邵娃，景夢曉，付婷婷，王艷宏,李永吉

(黑龍江中醫(yī)藥大學，黑龍江 哈爾濱 150040)

狗皮膏始載于明代陳文治所著《瘍科選粹》，自1963年起，收載于歷版《中國藥典》。狗皮膏由生川烏、生草烏、青風藤、大黃、乳香、沒藥、冰片等29味藥物組成[1]，具有祛風散寒，活血止痛，用于風寒濕邪、氣血瘀滯所致的痹病，或跌打損傷、閃腰岔氣、局部腫痛；或寒濕瘀滯所致的脘腹冷痛、行經(jīng)腹痛、寒濕帶下、積聚痞塊。在國家藥品監(jiān)督管理局官方網(wǎng)站搜索“狗皮膏”得到40條記錄，涉及杭州朱養(yǎng)心、貴陽濟仁堂等30個生產(chǎn)廠家。目前，《中國藥典》狗皮膏的質(zhì)量標準中尚未建立含量測定方法。

在狗皮膏制作過程中，藥材飲片需經(jīng)高溫油炸，所含化學成分的結構易發(fā)生改變，前期課題組發(fā)現(xiàn)，大黃素、蘆薈大黃素等兩種蒽醌類成分結構相對穩(wěn)定，可作為含量測定的對象。狗皮膏組方藥味較多，成分復雜，2020年版《中國藥典》一部收錄狗皮膏的處方、制法、功能主治等內(nèi)容，檢查項下僅要求符合外觀性狀、軟化點、重量差異等通則各項規(guī)定，并未收錄詳細質(zhì)量標準等，且目前為止對其研究報道較少[2]，為完善相關內(nèi)容，課題組前期研究已鑒定出大黃素、麻黃堿等27個有明確來源的中藥成分。通過參考相關文獻[3-5]，本實驗首次采用UPLC-MS/MS同時測定狗皮膏中兩種大黃蒽醌類含量測定的方法，為進一步完善狗皮膏的質(zhì)量標準提供實驗依據(jù)，對于狗皮膏的全面質(zhì)量控制有一定的應用和參考價值。

1 材料與儀器

1.1 材料

色譜甲醇、乙腈(Merck KGaA公司)；質(zhì)譜乙酸(Merck KGaA公司)；蒸餾水(屈臣氏公司)；大黃素對照品(批號：MUST-18110810，純度≥98.7%)、蘆薈大黃素對照品(批號：MUST-18091910，純度≥98.3%)均購于成都曼斯特生物科技有限公司，狗皮膏由實驗室自制。

1.2 儀器

Xevo-TQD三重四極桿質(zhì)譜儀帶有Waters Masslynx V4.1數(shù)據(jù)工作站、ACQUITYBEH C18色譜柱(上海沃特世科技有限公司)；New Classic電子天平(New Classic)；電子天平N-1300旋轉蒸發(fā)儀(上海愛郎儀器有限公司)；移液槍(Thermo Fisher Scientific)；SB-5200D型超聲波清洗機(寧波新芝生物科技股份有限公司)。

2 方法與結果

2.1 色譜條件

ACQUITY BEH C18(100 mm×2.1 mm，1.7 μm，Waters)色譜柱；以乙腈為流動相A，0.1%乙酸為流動相B；大黃素、蘆薈大黃素梯度洗脫條件為：0～3 min，30%～60%A，3～10 min，60%～60%A；流速為0.3 mL·min-1；溫度30 ℃；進樣量為0.4 μL。

2.2 質(zhì)譜條件

Waters UPLC-TQD三重四級桿液質(zhì)聯(lián)用儀，電噴霧(ESI)離子源，掃描方法為MRM，具體條件見表1。

表1 目標成分的MS參數(shù)

2.3 對照品溶液的制備

分別精密稱取大黃素、蘆薈大黃素對照品，置于10.00 mL量瓶中，加入色譜級甲醇配制成0.39 μg/mL、0.36 μg/mL，為對照品溶液，備用。

2.4 供試品溶液的制備

分別取不同市售廠家的狗皮膏，去除膏藥背襯，精密稱取藥膏10.00 g，置于潔凈燒杯中，加入甲醇30.00 mL，將狗皮膏均勻鋪于燒杯中，使之與溶劑充分接觸，超聲處理4 h，靜置，放入冰箱冷藏72 h，趁冷過濾，重復過濾3次至溶液無油狀，將濾液減壓回收，色譜級甲醇溶解，轉移至10.00 mL量瓶中，定容，0.45 μm微孔濾膜濾過，作為狗皮膏供試品溶液。

2.5 方法學考察

2.5.1 專屬性考察

分別取大黃素、蘆薈大黃素對照品溶液和供試品溶液，按“2.3”項下進行制備，對色譜圖進行對比分析可知，在大黃素、蘆薈大黃素出峰位置無其他雜質(zhì)峰出現(xiàn)，峰形較好，見圖1～4。證明該方法的專屬性較好。

圖1 大黃素對照品溶液MRM圖

圖2 供試品溶液中大黃素溶液MRM圖

圖3 蘆薈大黃素對照品溶液MRM圖

圖4 供試品溶液中蘆薈大黃素溶液MRM圖

2.5.2 線性關系、檢出限與定量限考察

分別精密量取適當對照品于10.00 mL量瓶中，用甲醇稀釋，其中大黃素的濃度為0.11 mg/mL，蘆薈大黃素濃度為0.10 mg/mL，使用適當比例甲醇進行連續(xù)稀釋溶液制備出系列的標準溶液。其中大黃素的濃度為0.11、0.22、0.55、0.77、1.10 μg/mL，蘆薈大黃素的濃度為0.10、0.20、0.50、0.70、1.00、1.50、2.00 μg/mL，搖勻，過0.45 μm微孔濾膜。取上述不同濃度樣品進樣測定。繪制大黃素、蘆薈大黃素、大黃酚的標準曲線。結果顯示，大黃素、蘆薈大黃素在測定范圍內(nèi)呈良好的相關性，具體見表2。

表2 大黃素、蘆薈大黃素的線性關系、檢出限和定量限

2.5.3 精密度試驗

分別配制0.05、0.10、0.20 μg/mL 3種濃度的大黃素和蘆薈大黃素的對照品溶液進樣6次，連續(xù)3 d，得到峰面積，根據(jù)標準曲線計算，得到上述溶液的濃度并計算得到RSD值，測得結果：(0.049 1±0.000 7)、(0.100 9±0.001 6)、(0.201 4±0.001 9)μg·mL-1，其日內(nèi)精密度范圍分別為0.938 8%～1.624 5%、0.722 8%～1.532 2%；日間精密度范圍分別為1.456 6%～1.986 2%、0.902 9%～1.842 4%。

2.5.4 穩(wěn)定性試驗

按“2.4”項下方法制備溶液，于0、4、8、16、24 h進樣測定，得到峰面積，根據(jù)標準曲線計算含量和RSD值。大黃素、蘆薈大黃素的RSD值分別為3.68%(n=6)、2.00%(n=6)，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.5.5 重復性試驗

精密稱取6份狗皮膏，按“2.4”項下制備狗皮膏供試品溶液，分別進樣測定，計算含量和RSD值。狗皮膏中大黃素、蘆薈大黃素的RSD值分別為1.62%(n=6)，1.40%(n=6)，表明該方法重復性良好。

2.5.6 加樣回收率試驗

取自制狗皮膏，精密稱定9份質(zhì)量均為10.00 g的狗皮膏，按“2.4”項下方法制備出狗皮膏供試品溶液，3份為一組，分別精密加入大黃素、蘆薈大黃素對照品適量，按“2.4”項下方法制備供試品溶液，按照“2.1”和“2.2”項下色譜和質(zhì)譜條件分別進樣分析，計算加樣回收率和RSD值。大黃素、蘆薈大黃素平均加樣回收率分別為98.8%、99.0%，RSD分別為1.1%、0.8%。

2.6 樣品含量測定

按“2.4”項下方法制備供試品溶液，取對照品和供試品溶液適量，在“2.1”和“2.2”項下條件進行分析，采用UPLC-MS進樣分析測定，每批樣品測定6次取平均值。結果，采用上述液相-質(zhì)譜條件檢測狗皮膏中大黃素、蘆薈大黃素的含量，測得大黃素含量為(5.836±0.002 5)μg/g，蘆薈大黃素的含量為(2.049 4±0.006 8)μg/g。

3 討論

查閱文獻發(fā)現(xiàn)，2020年版《中國藥典》未收錄關于狗皮膏中成分的含量測定內(nèi)容。多位學者對狗皮膏用藥安全性進行考察，發(fā)現(xiàn)狗皮膏的生產(chǎn)現(xiàn)狀存在一定差異，且潛在毒性靶器官為腎臟[6-10]。針對目前安全性研究尚不完善且含量測定內(nèi)容較少的情況，有學者開展狗皮膏的含量測定實驗，黃惠瓊[11]等采用氣相色譜對不同廠家的狗皮膏進行分析，發(fā)現(xiàn)不同廠家質(zhì)量不均一、指紋圖譜相似度低。王森[12]選擇粉末入藥的丁香、肉桂，建立HPLC法測定丁香酚、桂皮醛等兩種成分的含量。本實驗首次使用UPLC-MS/MS法測定經(jīng)油炸入藥的大黃活性成分大黃素、蘆薈大黃素的含量。

狗皮膏屬于傳統(tǒng)劑型黑膏藥的一種，制作時中藥材經(jīng)過高溫油炸，藥物化學成分結構易發(fā)生變化，經(jīng)過前期課題組研究，大黃素、蘆薈大黃素等兩種大黃蒽醌類成分結構相對穩(wěn)定且含量較多，故選擇作為成分標記物，并對其進行檢測。通過本次實驗，建立兩種成分的體外分析方法并進行方法學考察，應用該方法進行含量測定，進而分析經(jīng)過高溫油炸、下丹成膏等特殊工藝的兩種成分含量，為后續(xù)研究奠定基礎。

由于前期實驗中分析時選取甲酸水-乙腈為流動相，本次實驗首先考察甲酸水，使用WATERS ACQUITY BEH C18(2.1 mm×100 mm，1.7 μm)色譜柱。結果表明，在使用甲酸水為流動相時，峰型較寬，初步推測可能目標化合物未能更好地電離。當選擇易讓目標化合物失電子的乙酸水-乙腈為流動相時，采用相同的色譜方法，化合物得到很好的分離，峰形尖銳且對稱。因此，選取乙酸水-乙腈為流動相。

采用靈敏度高、效率高、檢測限低的UPLC-MS/MS進行檢測，檢測器的離子利用率可達到100%，重復性、靈敏度及準確度高于離子阱。結果表明，這種方法的專屬性良好；定量限和檢測限、日間及日內(nèi)精密度、重復性、穩(wěn)定性均符合要求；并進行了加樣回收率的檢測，結果較好。說明該方法可以作為狗皮膏中大黃素、蘆薈大黃素的含量測定，為狗皮膏之后的分析奠定方法學基礎。

4 結論

本研究采用UPLC-MS/MS法測定狗皮膏中大黃蒽醌類的含量，大黃素含量為(5.836±0.002 5)μg/g，蘆薈大黃素的含量為(2.049±0.006 8)μg/g。制備對照品溶液并根據(jù)建立的UPLC-MS/MS方法進樣分析，得到的MRM色譜圖。在ESI+和ESI-模式下，采用MRM對其含量進行檢測，其中大黃素含量最高，蘆薈大黃素次之，為后續(xù)研究提供了實驗依據(jù)。