miR-663調控MMP11對妊娠滋養層細胞侵襲和遷移的影響

段昆茂，王世芳△，陳周紅

1.重慶醫科大學附屬第一醫院綦江醫院產科，重慶 401420； 2.重慶醫科大學附屬第三醫院婦產科,重慶 401120

子癇前期是妊娠期高血壓疾病的一種特殊類型，一般表現為妊娠女性在妊娠20周以后出現水腫、蛋白尿、高血壓，在分娩以后血壓恢復正常[1]。目前尚不清楚子癇前期的具體發病機制和病因，已知滋養層細胞是胎盤的主要組成部分，在胎盤形成和胎兒正常發育過程中具有重要作用，滋養層細胞侵入子宮螺旋動脈受限和過淺均可能夠誘導子癇前期的發生，改善滋養層細胞侵襲和遷移能力可能是抑制子癇前期的重要步驟[2]。微小RNA(miRNA)是一類沒有編碼蛋白質功能的RNA，可以通過與靶基因的3端非翻譯區(3′UTR)結合影響蛋白翻譯[3]。miRNA的功能很多，如調控細胞分化、凋亡、炎癥、衰老、氧化損傷、增殖等，還與很多疾病的發生有關[4]。既往研究顯示，子癇前期患者胎盤組織中miRNA表達異常，且影響滋養層細胞的功能[5]。miR-663是與腫瘤有關的調控因子，還與鼻息肉的產生、燙傷修復等過程密切相關[6-8]。研究顯示，miR-663在子癇前期患者中高表達[9]。目前尚不清楚miR-663在妊娠滋養層細胞遷移和侵襲中的作用。前期的預實驗發現，miR-663和基質金屬蛋白酶11(MMP11)的3′UTR端有互補結合位點，MMP11是基質金屬蛋白酶家族成員，在細胞運動、侵襲過程中發揮促進作用[10]。本研究通過探討miR-663調控MMP11對妊娠滋養層細胞遷移和侵襲的影響及機制，以期為改善子癇前期的預后提供方向。

1 資料與方法

1.1一般資料 收集2018年7月至2020年7月重慶醫科大學附屬第一醫院綦江醫院收治的妊娠期子癇前期患者行剖宮產留取的胎盤組織19例，同時收集健康妊娠女性行剖宮產留取的胎盤組織19例(對照組織)。

1.2方法

1.2.1實驗細胞與試劑 妊娠滋養層JEG-3細胞購自上海通派生物科技有限公司；DMEM培養液、CCK-8、二喹啉甲酸(BCA)蛋白檢測試劑盒購自北京索萊寶科技有限公司；miR-663 模擬物(mimics)和抑制劑(anti-miR-663)、模擬對照序列(miR-NC)及抑制劑對照序列(anti-miR-NC)由上海安必奇生物科技有限公司構建；MMP11過表達載體及其小干擾RNA(si-MMP11)、空載體(vector)、小干擾RNA陰性對照(si-NC)、MMP11野生型(WT)和突變型(MUT)熒光素酶報告載體均由湖南豐暉生物科技有限公司構建；MMP11、甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)抗體購自上海齊一生物科技有限公司。

1.2.2miR-663和MMP11 mRNA表達水平檢測 采用qRT-PCR檢測miR-663和MMP11 mRNA表達水平。采用Trizol試劑提取子癇前期患者胎盤組織和對照組織中的總RNA，利用紫外分光光度計檢測RNA水平和純度。然后利用逆轉錄試劑盒將RNA逆轉錄為cDNA，以cDNA為模板，行PCR反應。PCR反應參數為：95 ℃預變性60 s；95 ℃變性30 s，60 ℃退火30 s，68 ℃延伸30 s，共40個循環。利用2-△△Ct法分析目的基因的表達變化，miR-663內參為U6，MMP11 mRNA內參為GAPDH。PCR引物為：U6上游引物5′-ATTGGAACGATACAGAGAAGATT-3′，下游引物5′-GGAACGCTTCACGAATTTA-3′；miR-663上游引物5′-GTGCGTGTCGTGGAGTCG-3′，下游引物5′-TTTAGGCGGGGCG-3′；MMP11上游引物5′-TTCTACACCTTCCGCTACC-3′，下游引物5′-GGACTGGCTTCTCACCATCATAT-3′；GAPDH上游引物5′-GCACCGTCAAGGCTGAGAAC-3′，下游引物5′-TGGTGAAGACGCCAGTGGA-3′。

1.2.3細胞培養和分組 復蘇JEG-3細胞，用含10%胎牛血清的DMEM培養液置于CO2培養箱中培養。將2.5 mL對數期JEG-3細胞(5.0×104個/毫升)接種至6孔板中，用LipofectamineTM2000脂質體法，分別轉染anti-miR-NC(anti-miR-NC組)、anti-miR-663(anti-miR-663組)、miR-NC(miR-NC組)、miR-663 mimics(miR-663組)、Vector(Vector組)、MMP11過表達載體(MMP11組)，共轉染anti-miR-663與si-NC(anti-miR-663+si-NC組)、anti-miR-663與si-MMP11(anti-miR-663+si-MMP11組)。同時設置對照組(Control組)：不進行任何轉染操作，常規培養。轉染6 h后，更換新鮮培養液。培養24 h后，采用qRT-PCR檢測Control組、anti-miR-NC組和anti-miR-663組miR-663表達驗證轉染效果，具體方法同1.2.2；采用蛋白免疫印跡(Western blot)法檢測Control組、anti-miR-NC組、anti-miR-663組、miR-NC組和miR-663組細胞中MMP11蛋白表達水平，觀察miR-663對細胞中MMP11蛋白表達水平的影響，同時檢測Vector組、MMP11組、anti-miR-663+si-NC組、anti-miR-663+si-MMP11組MMP11蛋白表達驗證轉染效果。

1.2.4細胞增殖檢測 采用CCK-8法檢測Control組、anti-miR-NC組、anti-miR-663組、Vector組、MMP11組、anti-miR-663+si-NC組和anti-miR-663+si-MMP11組細胞增殖情況。將0.2 mL各組細胞(5.0×104個/毫升)接種到96孔板，培養24 h后，每孔加10 μL CCK-8。孵育3 h，在酶標儀上測定450 nm處吸光度(A)值。

1.2.5細胞遷移和侵襲檢測 利用孔徑為8 μm的Transwell小室測定Control組、anti-miR-NC組、anti-miR-663組、Vector組、MMP11組、anti-miR-663+si-NC組和anti-miR-663+si-MMP11組細胞遷移及侵襲情況。侵襲實驗：預先在Transwell小室的上室添加人工基質膠，自然晾干。然后于上室加100 μL各組細胞懸液(5.0×104個/毫升)，下室中添加500 μL含10%胎牛血清的DMEM培養液。在培養箱中孵育24 h，將Transwell小室取出，擦掉沒有穿膜的細胞，放在4%多聚甲醛溶液中固定10 min，將小室取出，風干后進行蘇木精染色。選擇4個視野，計數細胞穿膜數量。遷移實驗：除不鋪基質膠外，步驟與侵襲實驗相同。

1.2.6靶向關系預測及鑒定 采用生物信息學軟件targetscan分析miR-663的靶基因。以熒光素酶報告系統鑒定二者的靶向關系。將miR-663 mimics、miR-NC分別和WT、MUT熒光素酶報告載體共轉染到JEG-3細胞，培養24 h后，用熒光素酶活性測定試劑盒分析細胞熒光素酶活性變化。

1.2.7MMP11蛋白表達水平檢測 采用Western blot檢測各組細胞中MMP11蛋白表達水平。將2.5 mL各組細胞(5.0×104個/毫升)接種至6孔板中，培養24 h后，棄培養液，用RIPA試劑提取細胞中總蛋白，用BCA法測定蛋白表達水平。用微量加樣器取25 μg的蛋白樣品分別加入SDS-PAGE凝膠樣品孔內，接通電源。前30 min，以70 V的電壓電泳，然后調整為100 V繼續電泳約1.5 h，肉眼可見藍色染料進入到底部邊緣。取出凝膠，放在電轉液內結合15 min。設置100 V的電壓轉膜1 h。電轉結束后，將分離蛋白轉移至硝酸纖維素膜，并浸泡在含有5%脫脂奶粉的平皿內，在室溫孵育2 h。然后放在MMP11(1∶1 000)、GAPDH(1∶1 000)一抗溶液中于4 ℃冰箱中孵育過夜，洗膜后，再放在二抗(1∶2 000)溶液中室溫孵育2 h。滴加顯影液避光顯影，曝光拍照，分析條帶灰度值。以MMP11與GAPDH灰度值的比值表示MMP11蛋白表達水平。

2 結 果

2.1子癇前期患者胎盤組織和對照組織中miR-663表達水平比較 與對照組織比較，子癇前期患者胎盤組織中miR-663表達水平升高(P<0.05)，miR-663在子癇前期患者胎盤組織中呈高表達，見圖1。

注：與對照組織比較，*P<0.05。

2.2miR-663 inhibitor轉染后妊娠滋養層細胞中miR-663表達水平比較 與Control、anti-miR-NC組比較，anti-miR-663組妊娠滋養層細胞中miR-663表達水平降低(P<0.05)，見表1。

表1 miR-663 inhibitor轉染后妊娠滋養層細胞中miR-663表達水平比較

2.3下調miR-663對妊娠滋養層細胞增殖、遷移和侵襲的影響 與Control、anti-miR-NC組比較，anti-miR-663組妊娠滋養層細胞增殖活性升高，遷移和侵襲數目增加(P<0.05)。下調miR-663能促進妊娠滋養層細胞增殖、遷移和侵襲。見表2。

表2 下調miR-663對妊娠滋養層細胞增殖、遷移和侵襲的影響

2.4miR-663與MMP11的關系 生物信息學軟件顯示miR-663和MMP11存在結合位點，見圖2，提示miR-663和MMP11為靶向關系。與miR-NC組比較，miR-663 mimics和WT共轉染后的妊娠滋養層細胞熒光素酶活性降低(P<0.05)，見表3。

圖2 miR-663和MMP11結合位點

表3 miR-663 mimics和MUT、WT共轉染后的妊娠滋養層細胞熒光素酶活性比較

2.5miR-663對MMP11表達的調控作用 與Control、anti-miR-NC組比較，anti-miR-663組妊娠滋養層細胞中MMP11蛋白表達水平升高(P<0.05)；與miR-NC組比較，miR-663組妊娠滋養層細胞中MMP11蛋白表達水平降低(P<0.05)，提示miR-663負調控MMP11表達。見圖3、表4。

表4 miR-663 inhibitor轉染后妊娠滋養層細胞中MMP11蛋白表達水平比較

圖3 miR-663 inhibitor轉染后妊娠滋養層細胞中MMP11蛋白表達情況

2.6子癇前期患者胎盤組織和對照組織中MMP11 mRNA表達水平比較 與對照組織比較，子癇前期患者胎盤組織MMP11 mRNA表達水平降低(P<0.05)，提示MMP11 mRNA在子癇前期患者中表達下調。見圖4。

注：與對照組織比較，*P<0.05。

2.7抑制MMP11逆轉下調miR-663對妊娠滋養層細胞增殖、遷移和侵襲的作用 與Control、Vector組比較，MMP11組妊娠滋養層細胞中MMP11蛋白表達水平升高，增殖活性升高，侵襲數目和遷移數目增加(P<0.05)。與anti-miR-663+si-NC組比較，anti-miR-663+si-MMP11組妊娠滋養層細胞中MMP11蛋白表達水平降低，增殖活性降低，侵襲數目和遷移數目減少(P<0.05)。見圖5、表5。

圖5 Western blot檢測妊娠滋養層細胞中MMP11蛋白表達

表5 各組妊娠滋養層細胞MMP11蛋白表達水平、增殖活性(A值)、侵襲數目、遷移數目比較

續表5 各組妊娠滋養層細胞MMP11蛋白表達水平、增殖活性(A值)、侵襲數目、遷移數目比較

3 討 論

胚胎發育與功能性胎盤的形成有關，囊胚期的胚胎細胞分化形成內細胞團和滋養外胚層細胞，內細胞團分化形成胎兒，滋養外胚層細胞分化形成不同的滋養層細胞，滋養層細胞不斷增殖分化，最終形成具有侵襲能力的多層絨毛外滋養層細胞，絨毛外滋養層細胞遷移、侵襲至子宮蛻膜，進入母體的螺旋動脈，維持子宮正常功能，為胚胎發育提供有利條件[11-12]。研究顯示，滋養層細胞侵襲、遷移受限是子癇前期發生的關鍵原因[13]。

miRNA是一類長度在22 nt左右的非編碼RNA分子，這類分子可在轉錄后調控其靶基因的表達[14]。miRNA在進化上極為保守，在不同組織和細胞中的表達豐度不同[15]。miRNA的異常表達常常與疾病有關，如miRNA在腫瘤中可發揮類似癌基因或抑癌基因的作用，通過影響細胞的增殖、凋亡等發揮作用[16]?，F階段已經發現了數千個miRNA，影響人體內30%的基因表達，在生命進程中發揮十分重要的作用[17]。miRNA在子癇前期中可通過調控滋養層細胞的遷移和侵襲發揮作用[18]。既往研究表明，子癇前期患者胎盤組織中miR-663表達水平升高，提示miR-663可能參與子癇前期的發病過程[9]。本研究結果顯示，miR-663在子癇前期患者中表達水平升高，并且下調miR-663可加快滋養層細胞的增殖，誘導細胞遷移和侵襲，miR-663可能具有加快子癇前期進展的作用。

miRNA的功能多樣性與其調控機制有關，miRNA與靶基因的3′UTR端通過堿基互補結合，進而影響靶蛋白的表達，并且同一個miRNA可同時有多個靶基因，分別參與不同的生理、病理調控過程[19-20]。本研究發現，miR-663與MMP11的3′UTR端互補結合，并且miR-663靶向負調控MMP11表達。MMP11是基質金屬蛋白酶家族成員，而基質金屬蛋白酶家族是細胞外基質降解的關鍵蛋白酶[21-22]。細胞合成的基質降解酶能夠為細胞的運動、遷移和侵襲提供條件[23]。本研究發現，子癇前期胎盤組織中MMP11表達水平降低，并且上調MMP11可增強滋養層細胞的侵襲、遷移和增殖能力，提示MMP11在子癇前期中可能發揮抑制作用。同時本研究還設置了逆轉實驗，證明抑制MMP11逆轉了下調miR-663對滋養層細胞侵襲、遷移和增殖的促進作用，這進一步說明下調miR-663可使MMP11的表達下調，從而促進滋養層細胞的侵襲、遷移和增殖，miR-663在子癇前期中的作用機制可能與MMP11有關。

綜上所述，miR-663可能具有促進子癇前期發展的作用，并且下調miR-663可靶向促進MMP11增強滋養層細胞的侵襲、遷移和增殖能力，目前尚不明確miR-663是否能通過其他途徑影響滋養層細胞侵襲，這些內容會在以后的研究中進一步探討。本研究為明確子癇前期的分子發生機制和靶向基因治療子癇前期提供了思路。