注射用肉毒毒素制劑及其研發進展

屈見聞，潘 博，趙雪蓮

（1.中國醫學科學院北京協和醫學院整形外科醫院整形七科，北京，100144；2.河北醫科大學第二醫院整形外科，石家莊 河北，050000）

自1979年Scott[1]首次將A型肉毒毒素應用于矯正眼外肌失衡作為斜視手術的替代方法以來，注射肉毒毒素已成為各種局灶性肌張力障礙的治療選擇。1987年，加拿大眼科醫生Jean Carruthers在注射肉毒毒素治療眼瞼痙攣時，偶然發現眉間紋消失了。她和她的丈夫皮膚科醫生Alastair Carruthers于1996年發表了一份關于肉毒毒素在美容中應用的報告[2]。1992年，Schantz和Scott公布了A型肉毒毒素治療皺紋的用途。自那以后，開啟了肉毒毒素在美容整形領域的開創性治療，包括消除額肌紋、魚尾紋、頸闊肌紋、提眉、治療咬肌肥大、改善面部輪廓、腿部塑形等[3-5]。肉毒毒素注射已成為中國最受歡迎的美容手段之一，本文概述了注射用肉毒毒素的作用機制，目前美國和中國上市肉毒毒素制劑，以及肉毒毒素制劑的研發進展。

1 肉毒毒素的作用機制

肉毒毒素是由肉毒桿菌(Clostridium botulinum)分泌的神經毒素、外毒素，共有A-G七種血清型，盡管各種類型毒素的氨基酸序列和免疫性存在差異，但它們均顯示出相似的分子結構。在細胞水平上，細菌分泌的毒素復合物包括肉毒毒素分子和非毒素蛋白（血凝素蛋白和非血凝素蛋白）。其中非毒素蛋白可以穩定復合物中的毒素分子，同時防止其吸收時被消化酸變性[6]。事實上，復合物中起主要作用的是約150kDa無活性的單鏈多肽，其進入機體后被活化成分子量為100kDa重鏈(High chain,HC)和50kDa的輕鏈(Light chain,LC)，兩者通過二硫鍵、非共價相互作用以及由重鏈N端組成的獨特片段圍繞球形的輕鏈結構域相連接[7]。

最新研究表明，肉毒毒素作用機制大致分為5個過程[8]：①結合：通過消化道吸收或者局部注射的肉毒毒素進入血液循環后，迅速來到神經末梢突觸間隙，依靠H鏈的C端，與神經節苷脂受體和突觸小泡腔中的受體結合[9]；②內吞：毒素通過內吞作用形成突觸小泡進入神經末梢；③移位：內吞體內pH下降，毒素變構，借助重鏈的N端在內吞體膜形成通道，將輕鏈結構域轉運至胞漿，此時依然通過二硫鍵保持連接[10]；④釋放：在硫氧還原蛋白還原酶-硫氧還原蛋白系統(Thioredoxin reductase-thioredoxin system,TrxR-Trx)作用下，兩條鏈分離，釋放輕鏈至胞漿[11]；⑤裂解：輕鏈裂解可溶性N-乙基馬來酰亞胺敏感因子附著蛋白受體(SNARE蛋白)，阻礙乙酰膽堿胞吐的發生。輕鏈為一種Zn2+依賴性的蛋白內切酶，可以裂解囊泡與質膜融合過程中關鍵的三種SNARE蛋白，即突觸融合蛋白(Syntaxin)、SNAP-25(Synaptosomal-associated protein of 25kDa)和突觸囊泡蛋白(Synaptobrevin/VAMP)，導致乙酰膽堿釋放障礙，從而引起神經麻痹[12]。因此，微小劑量的肉毒毒素能夠治療由功能亢進的神經末梢引起的疾病。

肉毒毒素在靶肌肉中的作用隨著時間的推移而減弱，神經和肌肉之間的信號傳導會逐漸恢復。事實上，目前尚不清楚毒素是如何從神經末梢代謝或以何種方式被清除的，對于毒素的吸收、分布、代謝和消除機制的認識仍沒有完全掌握。有學者認為，毒素不可逆地與突觸末梢結合后，這種蛋白會逐漸被人體降解，功能輕鏈從神經終板清除[13]，從而失去療效。亦有人認為，SNAP-25再生或終板旁生新芽形成新的神經聯接[14,15]，使神經肌肉的信號傳導和肌肉收縮力得以恢復。文獻回顧發現，肉毒毒素用于面部除皺治療的持續時間大多數為3至4個月，偶爾也可達到6個月[16]。為達到理想治療效果，患者一年內需多次注射以保持一定程度的改善，不僅增加治療費用，也減弱了其便捷性。因此，科學家們在不斷探索持續時間更長、效果更佳、安全性更高的新型肉毒素。

隨著BoNT/A適應癥進一步擴大，制劑的抗原性問題變得越來越重要。關于BoNT/A誘導的免疫原性問題備受爭議，然而，已經有許多治療失敗的報道和BoNT/A誘導的中和抗體的觀察[17]。研究發現，毒素復合物中的蛋白如血凝素可作為佐劑，增加機體對制劑注射的免疫反應。例如，血凝素-33是一種高度免疫反應性的神經毒素相關蛋白，可激活樹突細胞啟動免疫反應[18]，去除血凝素-33可最大限度地降低免疫原性?？贵w的形成是一個令人擔憂的問題，這可能導致隨著時間的推移療效下降，甚至治療無反應[19]。據報道，長期使用A型肉毒毒素治療超過10年以上的患者，體內產生中和抗體的發病率高達13.9%[20]。若患者對毒素復合物形成中和抗體后，再次注射時需要使用更大量的毒素才能達到同樣的療效，這種情況必須更加謹慎注射，以防大量毒素釋放入血引起肉毒毒素中毒[21]。

2 美國和中國上市的注射用肉毒毒素制劑

用于醫學治療的肉毒毒素主要為A型和B型，A型作用持續時間更長，而B型起效時間更快。目前，美國食品藥品監督管理局(FDA)批準4種在售的肉毒毒素制劑，包括3種A型肉毒毒素OnabotulinumtoxinA,IncobotulinumtoxinA,AbobotulinumtoxinA和1種B型肉毒毒素RimabotulinumtoxinB。中國國家藥品監督管理局(NMPA)批準上市的是OnabotulinumtoxinA，CBTX-A，以及2020年批準的AbobotulinumtoxinA和韓國Hugel公司生產的注射用A型肉毒毒素。

2.1 OnabotulinumtoxinA (Botox;Allergan,Inc.,Irvine,CA,USA)

Botox，中文名為保妥適，是一種無菌、凍干粉形式的A型肉毒毒素。主要用于治療眼瞼痙攣、面肌痙攣及相關局灶性肌張力障礙，同時也可以暫時改善成人中度至重度的眉間紋。Botox由C botulinum細菌的Hall株產生，并在含有N-Z胺和酵母提取物的特定培養基中培養。共有每瓶50U，100U和200U三種規格，每100U中包含0.5 mg的人血白蛋白和0.9 mg的氯化鈉。最初，由于擔心毒素的熱穩定性，在復原之前將藥瓶保存在冰箱中。但是證據表明，在使用前可以在冷藏溫度下安全存放至少36個月[22]。

2.2 AbobotulinumtoxinA (Dysport;Ipsen Limited,Slough Berkshire,UK)[23]

Dysport，中文名為吉適，是美國FDA在2009年批準的第二種神經調節劑[24]，于2020年中國獲批。自1990年以來，該制劑已在70多個國家/地區成功使用[25]。Dysport有300U和500U兩種規格，每500U中包含0.125 mg人血白蛋白和2.5 mg乳糖。Dysport與Botox在單位、化學性質、生物活性、重量等方面都不同。因此，這兩種劑型不具有互換性，給藥也不能基于單一的轉化率。最近證據表明Dysport:Botox接近2.5:1對治療除皺有效[26]。與所有神經毒素一樣，總體建議是使用毒素的量與肌肉肥大的程度相匹配，以達到預期效果。

2.3 IncobotulinumtoxinA (Xeomin;Merz Pharmaceuticals GmbH,Frankfurt,Germany)[27]

Xeomin是于2011年獲得FDA的批準A型神經毒素，用于治療慢性流涎、上肢痙攣、頸部肌張力障礙、眼瞼痙攣和眉間紋。共有50U和100U兩種規格，每100U中包含1 mg人血白蛋白和4.7mg蔗糖。Xeomin的純化過程將毒素從復合蛋白中分離出來，最終得到僅含有150 kDa活性成分的凍干產品[28]。因此，理論上它的免疫原性較小，降低了中和抗體產生的風險[29]。如果療程中需要注射大劑量肉毒毒素時，Xeomin具有一定優勢。

2.4 RimabotulinumtoxinB (Myobloc/NeuroBloc;Solstice Neurosciences Inc.,CA,USA)[30]

Myobloc是美國目前唯一可用的B型肉毒毒素。臨床應用幾乎僅限于神經肌肉疾病，包括頸部肌張力障礙，不過它已經成功地用于說明書注明以外的面部動態皺紋治療[31]。Myobloc是一種非凍干和穩定的液體制劑，規格有2500U/0.5mL，5000U/mL和10000U/2mL，其中每2500U/0.5mL中包含0.235mg人血白蛋白、2.9mg氯化鈉和1.35mg琥珀酸鈉。與療效可以持續3至4個月的A型肉毒毒素相比，Myobloc起效更快，但作用持續時間更短（約2個月）[32]，而且由于溶液的酸堿度呈酸性，注射時可能會引起疼痛，有一定的不適感。Myobloc與A型肉毒毒素無交叉反應，可有效地用于接受大劑量毒素且對A型肉毒素無反應或產生中和抗體的患者[33]。

2.5 CBTX-A (Prosigne/Lantox/Redux;Lanzhou Biological Products Institute,Lanzhou,China)

CBTX-A，商品名為衡力，是由中國蘭州生物制品研究所生產，活性成分為A型肉毒結晶毒素，生產用菌種為產毒力高的A型肉毒梭菌Hall株。每瓶含A型肉毒毒素50U或100U，輔料為蔗糖、右旋糖苷、明膠。相對于同體人血白蛋白，明膠為異體蛋白，需警惕過敏反應。CBTX-A主要用于治療眼瞼痙攣，面肌痙攣等成人患者及某些斜視，特別是急性麻痹性斜視，對于改善眉間紋也有一定的療效[34]。CBTX-A在≤8 ℃條件下可以保存3年，在室溫保存期限為6個月，藥品復溶后在2～8 ℃無菌條件可保存6天[35]。

2.6 LetibotulinumtoxinA (Botulax/Letybo;Hugel Inc.,Gangwon-do,Republic of Korea)

Letybo，中文名稱為樂提葆，韓國生物制藥公司Hugel生產的注射用A行肉毒毒素，于2020年獲得中國批準。生產菌種為肉毒梭菌CBFC26[36]，有效成分為900kDa肉毒毒素，賦形劑為氯化鈉和人血白蛋白，規格為100U/瓶，儲存條件在2-8℃。目前主要用于治療成人原發性眼瞼痙攣，中風后上肢痙攣，2歲以上腦癱患兒動態馬蹄足畸形，以及暫時改善與皺眉肌相關的皺紋，和成年人眼輪匝肌活動相關的眼部皺紋[37]。

雖然不同形式的肉毒毒素顯示出相似的效果，但每種產品都有獨特的制造工藝、賦形劑、配方等，且每種神經調節劑都有一條非平行的劑量-反應曲線，這意味著它們的相對性能在一系列劑量比范圍內并不一致[38]。因此，它們并不具有生物同一性。一種給定單位的毒素劑量與另一種毒素的轉化并非恒定的。臨床醫生必須徹底了解每種產品的特性和臨床性能，充分考慮患者的個性化需求，結合治療區域和適當劑量，以實現安全有效地使用。

3 研發進展

3.1 新型制劑

多數具有藥理作用的蛋白質具有粘附于固體表面的特性，在將其注入容器中時，部分蛋白質會粘附于容器內壁而造成活性成分的損失。同時，蛋白質易被氧化或被降解成小片段。因此商品化肉毒毒素制劑除包含純毒素分子或毒素復合物外，還添加了一種或多種賦形劑，如蛋白、離子化合物、糖等。蛋白主要指人血清白蛋白或明膠。然而，它們是動物來源的蛋白質，有攜帶血液中病原體而引發感染的風險。部分患者可能會對其產生變態反應，在重復注射后引起過敏[39]。

DaxibotulinumtoxinA for injection (DAXI/RT002,Revance Therapeutics,Inc,Newark,CA)，一款新研發的注射用A型肉毒素，不含人血白蛋白，避免了上述不良反應的產生。其主要成分為純化的150 kDa神經毒素，與凍干粉中的專利肽一起配制[40]。該肽具有帶正電荷的賴氨酸主鏈，可以與負電荷的核心神經毒素靜電結合，并允許在沒有人血清白蛋白的情況下配制DAXI，且保證其重構前的穩定性和作用效果[41]。此外，已證明該肽可提供高親和結合力，從而限制了注射后肉毒毒素的擴散，表現出更長的作用持續時間。對小鼠腓腸肌分別注射DAXI和Botox后測定肌肉麻痹結果顯示，兩者具有相同效力，且相鄰脛骨前肌的肌肉麻痹結果表明DAXI的擴散明顯較少。當使用既定劑量分別注射兩種制劑時，DAXI的作用持續時間可延長58%至100%[42]。此前人們認為，毒素復合物的分子大小決定了它在組織中的擴散能力，然而實驗研究表明，擴散系數與毒素復合物的大小無關[43]。目前已開展了使用DAXI治療眉間紋的1-3期臨床試驗[44-46]，結果顯示注射40U DAXI患者耐受性好，且具有最有利的風險-效益比，與20U Botox相比，表現出更高的應答率和更長的應答持續時間[47]。同時，DAXI治療皺紋嚴重程度恢復至基線的中位時間≥24周[48]。因此，其極有可能成為持續時間為6個月甚至更久的長效注射用A型肉毒毒素。

3.2 液體組合制劑

肉毒毒素分離的過程由一系列酸制劑產生，形成由活性毒素和血凝素蛋白組成的結晶復合體。然后將該制劑重新溶解在鹽水和蛋白中，消毒真空干燥，以凍干粉形式保存及運輸。凍干或冷凍干燥的過程，是指先將物質凍結，然后降低周圍壓力，使凍結凝固的水升華為氣相，這種方法可以最大限度降低由高溫引起的蛋白質變性風險。然而通過凍干等方式制備的干粉制品，需要在使用前進行重新溶解，使用時不方便。為了保證作用效果，需要仔細配制準確的濃度，溶解過程中存在稀釋造成毒素量的偏差。Botox制造商Allergan建議將不含防腐劑的生理鹽水緩慢注射到制劑小瓶中，通過緩慢旋轉小瓶將肉毒毒素與鹽水混合，避免劇烈攪拌，溶解后需保存在2℃至8℃之間，且24小時內使用[22]。有些人認為，泡沫的形成和劇烈攪拌可能會使肉毒毒素溶液易受氣泡引起的表面變性，或氣泡可能會導致毒素分散在小瓶表面從而影響療效。此外，稀釋過程可能會導致污染[49]。因此，對能夠改善便利性無需重新溶解，且能夠保證毒素穩定有效的液體組合制劑的需求不斷增長。研究者通過將一些賦形劑，如離子化合物、糖、聚山梨酯、糖醇等與毒素按不同比例組合，可以增強制劑的熱穩定性，增加溶解度，還可以減少聚集程度，在液態下穩定毒素分子并防止其變性。不僅可在常溫以上的高溫下維持肉毒毒素的活性，還可以維持長期的貯存穩定性。

3.3 工程化肉毒毒素

目前，市售肉毒毒素均通過培養天然肉毒桿菌，隨后進行一系列分離和純化毒素復合體來生產的，這種方式過程復雜且蛋白產量低。在下一代測序和重組技術的時代，基因工程重組蛋白的生產達到了新高度。通過將BoNT的DNA編碼部分（開放閱讀框）整合到大腸桿菌或其他微生物中，帶有BoNT開放閱讀框的微生物隨后產生毒素蛋白[43]。大腸桿菌表達系統允許使用簡單的培養基，從而實現大規模生產。生物安全風險也沒有培養肉毒桿菌大，因為用于異源表達的大腸桿菌菌株沒有致病性。這將為BoNT及其他神經毒素的轉基因提供一個標準化和更安全的生產過程[50]。事實上，構建全功能重組BoNT絕非易事，其中一個重要因素是成熟蛋白的雙鏈結構。如前所述，雖然最終發揮毒素效應的是輕鏈，單鏈BoNT蛋白也能夠進入神經元并在一定程度上抑制囊泡釋放，但它們的效力較低。此外，在不存在重鏈的情況下，分離的輕鏈在水溶液中難以溶解，且易受到蛋白水解酶降解?？梢?，雙鏈的二肽形式是BoNT發揮完全神經毒素所必需的[51]。這就要求保留連接兩條鏈的二硫鍵、結構域，同時保證兩者之間正確的折疊。因此，在體外單獨表達并將純化的重鏈和輕鏈生產活性雙鏈的過程是一項重大挑戰。

3.4 透皮給藥

目前臨床上使用的肉毒毒素制劑均為注射給藥，然而注射伴隨一些副作用，例如注射部位的刺激、炎癥、感染、出血等。對于多汗癥等情況，可能需要在敏感部位（如手掌或腋窩）進行多次皮下注射，導致患者不適甚至疼痛。透皮給藥系統 (Transdermal drug delivery system,TDDS)作為一種非侵入性治療方法，通過在皮膚表面給藥，使藥物以近似恒定的速率進入皮膚，產生全身或局部治療效果，具有良好的順應性及非創傷給藥的特點，成為目前研發的重點。從凝膠、乳膏、軟膏到即用型貼劑，增加了便利性，并減少了注射造成的不適。但由于生物屏障的限制及毒素分子量過大，難以透過皮膚，故需借助載體或外界設備透過皮膚屏障。目前正在開發的無針法遞送藥物的范圍相對淺表，尚不能替代那些涉及到使用BoNT治療深層肌肉運動障礙的注射方法。此外，這種方法缺乏靶向性，存在進入任何細胞的可能，會增加非特異性毒性的風險。

3.4.1 細胞穿透肽(Cell Penetrating Peptides,CPPs)

CPPs主要指來源于不同生物的短肽，具有共價或非共價附著到大分子（包括肽、蛋白質、核酸等）上的能力，并攜帶它們穿過細胞膜，而不發生任何構象變化[52]。常見的CPPs有HIV-TAT的多肽片段、觸角足突變(Antennapedia)?；罴毎麛z取CPPs的確切機制仍不清楚，目前推測與能量無關的細胞膜“直接轉運”和能量依賴的“胞吞作用介導的易位”有關[53]。Saffarian等[54]通過將BoNT/A輕鏈與TAT肽共價連接，構建了一種重組蛋白TAT-BoNT/A(1-448)。用BoNT/A輕鏈代替全蛋白來降低最終分子大小，增加了皮膚吸收的可能性。通過在小鼠皮膚表面上局部施用含TAT-BoNT/A溶液，免疫組織化學數據顯示30分鐘后觀察到了蛋白滲透的跡象，同時細胞內蛋白水平隨著時間的推移而增加。高效液相色譜分析表明，這種重組蛋白的生物活性是BoNT/A(1-448)蛋白的1.5倍。因此，他們認為TAT-BoNT/A具有生物活性，與作為對照的BoNT/A(1-448)相比，可以在體外和體內成功地通過活細胞傳遞，且更有效。Revance公司正在開發一種外用產品RT001（A型肉毒毒素凝膠）[55]，由純化的150kDa BoNT/A蛋白組成，配制在含有基于CPP的滲透增強肽賦形劑RTP004的泊洛沙姆(Poloxamer)凝膠中。隨后，開展了一系列2期研究證明RT001在治療中度至重度外側魚尾紋或多汗癥方面是安全有效的[56]。2015年，Revance宣布已開始在一項3期關鍵研究中對患者進行給藥，以評估RT001治療外側魚尾紋的安全性和有效性。然而該研究未達到其共同主要終點，因此停止了進一步的開發計劃[57]。

3.4.2 納米技術

許多機構正在研發出能夠幫助大分子和小分子藥物滲透到完整皮膚中的納米粒子。Chajchir等[58]報道了一種BoNT/A乳霜制劑(CosmeTox)，每毫升含有2U BoNT/A。這種新的藥物遞送方法基于小于1-10nm的混合膠束離子納米粒子技術(Ionic nanoparticle technology,InParT)，該技術將活性分子封裝在載體中，以增加其在皮膚中的生物利用度。Chajchir等希望將其用于治療那些害怕針頭和不想注射的人，或那些想延長肉毒毒素注射效果的人，在注射治療后長期使用這種乳膏作為維持治療，以減緩皺紋再次形成的過程。他們隨機選擇了40名女性受試者，每天晚上在面部、下巴和頸部外用CosmeTox或安慰劑霜，連續使用4-7周。使用CosmeTox的受試者整個過程總計外用BoNT/A可達50-70U。根據患者報告的面部線條結果評分問卷結果顯示，CosmeTox可以顯著改善面部特征和年齡外觀。然而由于使用固定的BoNT/A劑量非常低，這一結果令人驚訝，而且試驗結果是根據患者主觀感受填寫問卷，制劑的真實療效還有待進一步驗證。

3.4.3 借助外界設備

當含有小分子的液體置于弱電流下時，分子可獲得容易穿透完整皮膚表面的能力，這種技術稱為離子電滲療法(Iontophoresis)。通過這種方法，許多具有小分子、表面極性和適當水溶性的藥物可以安全無痛地輸送到皮膚中。BoNT/A為負電荷水溶性藥物，滿足離子導入的條件。Kavanagh等[59]利用離子電滲裝置(Iomed Phoresor II) 輔助BoNT/A透過皮膚，對這兩名嚴重手多汗癥患者進行治療。當用淀粉碘試驗進行測試時，治療結果令人滿意，甚至接近于注射型肉毒毒素(約70%)，證明了離子電滲確實可以成功地輸送肉毒毒素。然而，存在一些限制，包括該方法中使用的設備成本相對較高，長期和高頻率的治療周期增加了最終成本，另一方面，增加了皮膚過敏的可能性[60]。

經皮氣動噴射(Transcutaneous pneumatic injection,TPI)是指根據治療目的調節滲透壓力和溶液體積，將特定溶液微創但強力地輸送到皮膚中。Kim等[61]報告了一種利用壓力和劑量控制、無針、經皮氣動噴射法治療腋窩和掌跖多汗癥。在局部應用麻醉乳膏后，使用TPI裝置(Shemax?;Shenb Co.,Ltd)在2.05巴（壓強單位）下以0.08mL/shot將含有BoNT/A溶液噴射至治療區域，通過淀粉碘測試結果和多汗癥疾病嚴重程度量表評分來評估其功效。研究表明低濃度BoNT/A可以有效且安全地治療了腋窩和掌跖多汗癥，利用二維超聲發現BoNT/A在腋窩和掌跖皮膚的整個真皮和真皮-皮膚脂肪連接處產生了界限分明的浸潤區。然而，這項研究參與者少，隨訪時間短，缺乏對照組，并且沒有評估出汗的客觀指標。因此，需要在更大的人群中進一步證實其安全性和有效性。此外，沒有可靠的組織學證據證明BoNT/A在噴射后滲透到活的皮膚組織內?？紤]到BoNT/A全蛋白的大尺寸(150kDa)，它不太可能通過具有選擇性滲透性的皮膚細胞膜，如果正如作者所述，應該進一步解釋和探究BoNT/A進入皮膚的分子機制。

此外，也有將低頻超聲、X射線、核磁共振等與BoNT透皮給藥相結合[62]，這些方法將進一步擴大肉毒毒素在醫學美容領域的應用。

4 結論

肉毒毒素的使用為許多疾病提供了替代治療方案，也為整形美容行業帶來了巨大改變。市場上各類產品由于其不同的生產過程和條件，在單位、化學性質、生物活性和重量方面有所不同，因此不可簡單地互換。為了安全的臨床實踐，并獲得最佳療效，從業者必須徹底了解每種制劑的特性、規格、轉化率和安全性（毒素擴散和免疫原性）等臨床問題。此外，各大機構也在加快研發新興產品，新型制劑展現出巨大潛能，如提供更長的持續時間、更優的治療效果、更少的不良反應，甚至是更多樣化的給藥途徑。雖要拋棄新鮮事物“猛于虎”的思想，也應對其臨床應用的可行性進行全面地評價。隨著對毒素作用機制的更好理解和生物技術的進步，相信未來的產品會為患者提供更多的選擇。