結核分枝桿菌耐藥機制和治療的最新研究進展

丁 磊,徐俊馳,邱文娜,李 晉,胥 萍（.蘇州市吳江區兒童醫院/蘇州大學附屬兒童醫院吳江院區檢驗科,江蘇蘇州 500;.蘇州大學附屬傳染病醫院/蘇州市結核病防治重點實驗室，江蘇蘇州 5007）

結核病是全球傳染病死亡的首要死因。世界衛生組織（WHO）“global tuberculosis report 2018”報告顯示：2017年全球新發結核病患者約1 000萬例，我國約有90萬例，占全球9%；患有利福平耐藥結核病（rifampicin-resistant TB，RR-TB）患者約55.8萬例，其中耐多藥結核病（multidrug-resistant TB，MDR-TB）患者占比82%。我國患RR-TB/MDR-TB約7.2萬例，占全球13%[1]。耐藥結核病的治療費用極高，病死率占全球結核病死亡率的25%，且出現了對貝達喹啉（Bbq）、德拉馬尼（Dlm）等新藥耐藥及無藥可治的情況[2]。最新估算顯示全球約有23%的人群可能患有潛伏性結核感染，而每83例患有潛伏性結核感染的人中就有一人感染耐多藥結核分枝桿菌（Mycobacterium tuberculosis,MDR）株，在15歲以下的兒童中，每34例患有潛伏性結核感染的人中就有一人感染MDR株[3]。這些情況將會破壞全球結核病防治的進程，耐藥結核病防治工作已經到了刻不容緩的地步。本文將對近年來MTB耐藥機制和治療方案方面的研究進展進行綜述。

1 MTB耐藥分類

為了適應耐藥結核病防治新形勢，WHO 于2013年[4]重新修訂了耐藥結核病的分類和定義，增加了利福平耐藥，分類如下。①單耐藥：對任何一種一線抗結核藥耐藥；②多耐藥：對除利福平和異煙肼以外的任何一種及以上一線抗結核藥耐藥；③耐多藥：至少同時對利福平和異煙肼耐藥；④廣泛耐藥：在耐多藥的基礎上，還對任意一種氟喹諾酮類藥物和阿米卡星、卷曲霉素、卡那霉素這三種二線注射藥物之一耐藥；⑤利福平耐藥：不論患者對其他抗結核藥物是否耐藥，但是通過表型或基因型方法確定其對利福平耐藥。

2 MTB耐藥機制

目前部分闡明的MTB耐藥機制分為固有性耐藥機制（主要包括細胞壁滲透性降低、外排泵作用和細胞代謝）和獲得性耐藥機制（靶基因突變），且藥物作用的靶基因突變導致獲得性分子耐藥機制是MTB耐藥的主要機制，即獲得性突變是MTB耐藥的主要原因[5-7]。

2.1 固有耐藥機制

2.1.1 細胞壁特殊結構：MTB的耐藥機制相當復雜，與其它病原菌相比，其有獨特且復雜的細胞壁結構，對菌體構成強大的保護屏障，這種構造賦予MTB 對多種抗結核藥物天然的耐藥性[8]。MTB細胞壁富含脂類，內層主要是分枝菌酸包圍在肽聚糖層外面，外層主要是長鏈的脂肪酸，使得MTB 對大多數抗生素是不通透的[9]。已有研究表明，MTB細胞壁生物合成的過程對生物膜的形成很重要，MTB細胞壁的脂質主要負責生物膜的形成，這些生物膜被證明富有自由分枝菌酸，同時存在耐藥細胞[10]。Rv0024 編碼肽鏈內切酶，作為MTB 中NIpC/p60 蛋白家族第5 成員，主要參與生物膜的形成及耐藥性。研究顯示，非致病性恥垢分枝桿菌菌株在異煙肼和吡嗪酰胺這兩種抗結核藥物的耐藥性實驗中，Rv0024 基因的表達水平至少增加了10倍[11]。Wag31 作為DivIVA的同族體，參與細胞壁生物合成。Wag31 可以和6種脂肪酸與分枝桿菌酸合成相關的蛋白之間相互作用，包括InhA，AccA3，AccD4，ccD5，MmpL3和Fas。實驗表明恥垢分枝桿菌中 Wag31的表達水平下調，可增加恥垢分枝桿菌細胞壁對脂類分子的通透性，進而增強恥垢分枝桿菌對四種脂類抗生素（氯法齊明、利福平、新生霉素、紅霉素）的敏感性[12]。由此可見，找到編碼MTB細胞壁合成過程的靶基因，降低其表達水平是克服抗生素抗性的有效途徑。

2.1.2 藥物外排泵：細菌對進入其體內的抗生素會進行主動外排來減低菌體內藥物濃度，這是細菌產生耐藥的一個重要機制。細菌外排泵是位于細菌質膜中的轉運蛋白，目前發現有六種不同的轉運蛋白家族：MFS，SMR，MATE，ABC，RND，PACE[13]。結核菌屬中有大約20個基因被確定為編碼外排泵的相關基因，主要集中在MFS，RND，SMR[14]。MACHADO 等[15]研究顯示，暴露于低濃度抗生素中的耐異煙肼結核分枝桿菌菌株，大多數外排泵基因表達水平上調。結核桿菌泛素樣蛋白酶體系統（Mycobacterium tuberulosisubiquitin-like proteinproteaome system,MTB PPS）是由MTB 泛素樣蛋白與MTB 蛋白酶體組成，該系統介導的蛋白質降解過程中所需的輔助因子有Dop，PafA 和Mpa。MTB PPS 主要介導和調節結核分枝桿菌體內蛋白質的選擇性降解，對菌體的生長代謝發揮著重要調控功能[16]。張帥等[17]研究指出MTB PPS 對單耐異煙肼結核分枝桿菌耐藥的產生有影響，其作用機制可能是通過單耐異煙肼結核分枝桿菌外排泵的功能來調控的。但關于MTB PPS是否通過調節MTB 外排泵來調控其耐藥性的產生還尚無相關報道。因此，了解相應外排泵蛋白的功能，找到抑制其活性的方法是一種克服抗生素抗性的有效途徑。

2.1.3 MTB細胞代謝：抗生素誘導目標細胞產生有害活性氧（ROS）是一種常見的殺菌途徑。MTB 在使用抗結核藥物治療后產生抗藥性，因為它能夠重塑代謝網絡和電子傳遞鏈，從而繞過抗生素介導的ROS 產物，避免造成自身受到損傷[18，21]。海藻糖是MTB 中含量豐富的非還原葡萄糖二糖，是細胞表面海藻糖單菌酸(TMM)和海藻糖二菌酸(TDM)的核心成分。MTB 通過下調TMM/TDM 并重構海藻糖代謝產物從而進入非復制耐藥狀態[19-20]。LEE等[21]研究表明了MTB 改變其細胞內海藻糖代謝作為一種適應性策略，以實現短暫的藥物耐受，這可能是一種持久的生存策略，并在MTB 抵抗貝達喹啉、利福平及異煙肼的實驗中得到了驗證。研究表明在宿主體內，MTB 可分解代謝脂質，包括膽固醇等作為其主要營養成分。脂質分解代謝反過來又與脂質生物合成有關，這些脂質起著能量儲存、毒性和免疫調節相關因子的作用，是MTB 獨特而復雜細胞壁的組成部分。真核型蛋白激酶G（PknG）主要參與調節結核分枝桿菌毒力，與底物GarA 通過蛋白-蛋白結合調節結核分枝桿菌和其他放線菌的三羧酸循環,缺乏PknG 基因表達的結核分枝桿菌的毒力在小鼠的巨噬細胞中嚴重減低[22]。因此，深入研究MTB的細胞代謝過程，找到細胞代謝過程中的某一限速酶，可能是MTB治療的新靶點。

2.2 獲得性耐藥機制 獲得性耐藥可能通過基因突變或水平基因轉移發生，但在MTB 中通過質粒或可移動遺傳原件水平轉移耐藥基因的研究尚未見報道，所有目前已知的MTB 獲得性耐藥是通過抗生素使用的選擇性壓力下染色體突變介導的[7，23]。常見的結核耐藥相關基因有：利福平（rpoB）、異煙肼（KatG，inhA，ahpC，kasA，ndh）、乙胺丁醇（embCAB，embR）、吡嗪酰胺（pncA，rspA）、鏈霉素（rpsL，rrs，gidB，whiB7）、阿米卡星/卡那霉素(rrs，eis，whiB7)、乙硫異煙胺（ethA，ethR，inhA，ndh，mshA）、氟喹諾酮類藥物（gyrA，gyrB）、環絲氨酸（alrA，cycA，ddl）、對氨基水楊酸（thyA，dfrA，folC，ribD）、卷曲霉素（tlyA，rrs）等。不同基因或相同基因不同位點突變頻率各不相同，所引起的耐藥程度也均有差異。以利福平耐藥為例，超過96%的利福平耐藥菌株在rpoB 基因81 bp 熱點區域(密碼子507～533位點)發生突變。最常見的突變發生在密碼子531 和526，占利福平耐藥株的62.5%～81.1%。531 和526位點突變對利福平產生高水平耐藥，511，514，522，533 等位點突變對利福平產生低水平耐藥[24-25]。再以異煙肼耐藥為例：約50%～85%的異煙肼耐藥菌株發生在katG（315位點）突變，其中katG 基因片段完全缺失約占異煙肼耐藥的8%～25%，另外點突變、堿基對插入及部分缺失也會引起異煙肼耐藥[25-26]；約10%～40%的異煙肼耐藥發生在inhA 突變，當katG 和inhA 同時發生突變時，MTB耐異煙肼的能力顯著增強，這種情況約占異煙肼耐藥的20%[25，27]，katG 和inhA 突變是異煙肼耐藥的主要原因，其次是ahpC，kasA，ndh，iniABC，fadE，furA，Rv1592c 和Rv1772[28]。另外，利福平和異煙肼耐藥結核分枝桿菌的突變頻率還因地理位置而異，掌握這些結果有利于更好地了解當地耐藥結核病的傳播及演變動態[27,29]。因此詳細了解MTB耐藥的相應靶基因，有利于耐藥結核病的早期診斷、新藥研發及制定更加優化的治療方案。

3 MTB治療最新進展

3.1 化學藥物治療方案 化療是治療結核病的首選方法，2008年[30]，2014年[31]，2016年[32]WHO 指南均將抗結核藥分為5組：2014年將Bbq，Dlm 加入第5組；2016年將5組藥物進行重新分類，將口服藥物利福平（RIF）、異煙肼（INH）、吡嗪酰胺(PZA)、乙胺丁醇（EMB）劃歸一線抗結核藥,將二線抗結核藥分為A，B，C，D 四組，其中A組（氟喹諾酮類）、B組（注射用抗結核藥）、C組（口服抑菌類）為核心二線藥，D組（療效不確切，又分為D1，D2，D3 三個小組）為非核心附加藥物。

WHO 于2016年更新發布了“耐藥結核病治療指南”[32]，第一次推出MDR-TB 短期化療方案。WHO 于2018年8月發布了“關于耐多藥和利福平耐藥結核病治療重大變化”[33]的文件，根據各成員國通報的最新數據進行薈萃分析，對耐多藥結核病長程治療方案推薦使用的藥物重新分組。2018年12月底發布指南：耐多藥和利福平耐藥結核病的治療(更新版)[34]，對新的藥物分組進行了肯定。短程治療方案（療程為9～12個月）和長程治療方案（療程為≥20個月）各有優缺點，二者在設計原則、藥物組成、患者適應癥、用藥負擔等方面均不相同，目前關于短期治療方案的相關研究仍在優化中[35-36]。

3.2 免疫治療方案 單一的化學治療難以治愈耐多藥的結核病，WHO 在20 世紀90年代提出化學與免疫治療相結合的方案，但由于臨床上免疫制劑的選擇、用量、療程等諸多問題，目前免疫治療仍是一種輔助治療手段。免疫治療主要通過調節T淋巴細胞、調節自身免疫、誘導細胞免疫應答、活化巨噬細胞等來清除體內MTB，治療藥物主要包括：疫苗、細胞因子、抗體、免疫調節劑及其它生物制劑等[37]。研究表明細胞外囊泡（EVs）攜帶微生物組分并在宿主防御感染中起重要作用，MTB RNA 通過SecA2 依賴性途徑傳遞到巨噬細胞衍生的EVs中，并且從MTB 感染的巨噬細胞釋放的EVs 刺激宿主RIG-I/MAVS/TBK1/IRF3 RNA 傳感途徑，導致受體細胞產生I型干擾素。這些EVs 還以RIG-I/MAVS 依賴性方式促進含MTB的吞噬體通過非經典LC3 途徑成熟，增強殺滅細菌能力[38]。白細胞介素-32（IL-32）在宿主抵抗諸如MTB 等病原體方面起著重要作用，IL-32 存在6種選擇性剪接亞型，其中IL-32ε 具有最強的抗結核作用，誘導MTB細胞凋亡率最高[39]。相信隨著免疫學研究的發展，新的免疫治療藥物將在MTB治療中起到至關重要的作用。

3.3 改變給藥方式或藥量 目前國內關于常用抗結核藥物在霧化吸入、氣管內給藥、空洞內給藥等給藥方式以及藥物超劑量用法等方面形成了專家共識[40]。SANKHE 等[41]研究新型的肺部給藥系統能增強新的/現有的抗結核藥物的功效、增強患者的依從性，從而減少副作用、治療的頻率和治療時間。Bello-Monroy等[42]研究發現在感染了MDR株的BALB/C 小鼠中，通過管飼或氣管內途徑高劑量使用利福平和異煙肼，并聯合重組人干細胞生長因子，在降低肝損傷的同時能起到較好地清除小鼠肺部耐藥結核菌的效果。新的臨床給藥方式的應用雖然取得了一些成效，但仍處于探索階段，因此還需長期觀察。

3.4 尋找治療新靶點 隨著二代測序技術和全蛋白質組測序技術的廣泛應用，近年來大量新的治療靶點被發現。一種策略是通過針對結核桿菌生長所必需的信號通路設計新的靶向藥物。GroEL2[43]和GuaB2[44]是結核生長所必需的分子，現有研究通過靶向抑制GroEL/ES（HSP60/10）蛋白系統或者GuaB2 蛋白可以減緩結核桿菌的生長。另一種策略則是通過增加宿主對結核桿菌的免疫力，蛋白酪氨酸磷酸酶B（PtpB）是MTB 免疫逃避的重要蛋白，WASHBURN 等[45]人的研究發現PtpB 抑制劑可有效增加宿主針對MTB 免疫反應，抑制肉芽腫形成使其成為結核免疫治療的新靶點。還有研究發現以PD-1為代表的免疫卡控點在結核感染時期發生異常表達，通過相應的免疫卡控點阻斷抗體很可能為結核病的治療提供新的治療方向[46]。

4 MTB治療展望

MTB的耐藥機制非常復雜，至今為止尚未完全闡明。而新機制的發現對耐藥結核病的診斷和新藥研發均意義重大，因此還需廣大學者進一步深入研究。新藥研發成本高、周期長、難度大，全球應聯合起來，相互協作，資源共享。政府應引起重視，加大人才、資金、設備投入，加快新藥研發進程。進而優化治療方案，提高治療效率。另外需加強特效、長效結核病疫苗的研發，包括預防性和治療性疫苗，從源頭上遏制結核病的傳播。在關注耐藥結核病發病機制和研發新藥的同時，也要注重耐藥結核病患者的治療管理，盡可能結合患者自身情況制定個體化方案。只有多管齊下，才能最終實現消滅結核病的目標。