腫瘤外泌體標志物應用及靶向治療進展

江佳佳，吳佩佩，許文榮

(1. 江蘇大學附屬澳洋醫院腫瘤研究院，江蘇 蘇州 215600； 2. 江蘇大學醫學院，江蘇 鎮江 212013)

惡性腫瘤的早預防、早診斷和早治療是精準醫學和個體化治療的關鍵。目前臨床采用的腫瘤診斷指標多為血清中蛋白類分子，其特異性及敏感性均不高[1]，因此，亟須開拓早期非創傷性的診斷標志物。液體活檢是一種非侵入性的血液檢測突破性技術，能早期快速地檢測腫瘤及其病灶或者轉移過程中釋放到血液中的循環腫瘤細胞(circulating tumor cell，CTC)、循環腫瘤DNA(circulating tumor DNA，ctDNA)和腫瘤外泌體等腫瘤組分。腫瘤外泌體作為液體活檢的一個重要組成，基于其內容物成分多樣和穩定等優勢，正成為腫瘤標志物相關研究的熱點。

腫瘤異質性、復發、轉移和耐藥等依然是腫瘤難治的主要原因，而以手術、化療和放療為主的治療手段，由于靶向性不足、藥物和放療的毒副作用等諸多挑戰，導致腫瘤的治療效果不佳。有研究表明，腫瘤治療不能僅針對惡性腫瘤細胞，更要考慮到腫瘤微環境的影響[2]。腫瘤來源納米大小的外泌體具有易通過血腦屏障、天然的歸巢特性、雙分子層脂質結構的穩定性和高效的生物相容性等特征。因此，腫瘤外泌體正成為腫瘤靶向治療理想的載體，尤其是工程化外泌體更表現出卓越的腫瘤靶向干預和增強藥物治療的效果(圖1)。

1 腫瘤外泌體與液體活檢

疾病診斷和預后監測的理想生物標志物一般具備以下特點：通過無創性操作易于獲得，高度的敏感性和特異性，對疾病的早期階段具有診斷能力，樣本有較長的半衰期，檢測方法快速準確等。針對CTC、ctDNA和腫瘤外泌體等成分進行檢測的液體活檢技術已成為轉化醫學研究中快速發展的領域[3]。外泌體能攜帶多種生物活性分子循環于血液/體液中并介導長距離的細胞間通訊，腫瘤來源外泌體富含的蛋白質、核苷酸、脂質等分子能夠反映其來源細胞的生理及病理狀態，外泌體特殊的脂質雙分子層結構能保護其內RNA等分子免于降解，因此，檢測腫瘤外泌體成為液體活檢一個顯著優勢[4-5]。臨床試驗研究表明，外泌體在多種疾病的早期診斷、療效和預后監測等方面都具備較好的應用價值，正逐漸成為臨床診療中新的、理想的生物標志物和可能的靶向藥物載體。隨著技術的進步，組學時代的到來，大規模蛋白質組學已經被聯合應用于篩選和揭示多種癌癥細胞外囊泡的標志物[6]。

1.1 腫瘤外泌體樣本的采集

在血液和大多數體液(如尿液、腦脊液、唾液、胸腹腔積液、羊水和乳汁等)中均可檢測到外泌體。血液外泌體的檢測通常采用EDTA抗凝血分離的血漿，miRNA等一些微小RNA則采用血清樣本[7]。泌尿系統中存在大量的RNA水解酶可降解尿液中的裸miRNAs，但外泌體外膜則可幫助RNA免于被降解，因此研究尿液外泌體miRNAs更具有應用價值[8]。相較于血清中相關miRNA的水平，腦脊液外泌體中的miR-21可作為膠質瘤診斷和預后的指標，特別對預測腫瘤復發或轉移具有價值[9]。唾液樣本在安靜狀態下主要來源于舌下腺和頜下腺，刺激狀態下則主要來源于腮腺[10]。

1.2 腫瘤外泌體樣本的提取

目前較為常用的外泌體提取方法包括離心法(超速差速離心法、蔗糖密度梯度離心法)，磁珠分選法，微流控技術和試劑盒法提取試劑盒等。而不同提取方法獲得的外泌體在產量、純度和顆粒完整性等方面差異較大。超速差速離心法是目前較為公認的分離外泌體的經典方法，被用于細胞培養液及體液的外泌體分離，主要是基于細胞外囊泡(extracelluar vesicles，EVs)的大小、密度等，但耗時且所獲得的外泌體純度低，并可能會破壞其形態學結構[7]。蔗糖密度梯度離心法根據不同物質密度分離外泌體，所獲得外泌體純度較高，適用于外泌體形態學的鑒定，但耗時、產量低[7]。免疫磁珠捕獲法通過結合單克隆抗體來捕獲暴露特定配體的EVs，簡單省時且分離純度較高，可用于臨床，但不適于大體積樣本的分離，且所獲外泌體活性受到一定影響，不利于后續功能學研究[7]。微流控技術是利用外泌體在微量體上的物理和生物化學特性來進行快速有效地分離，省時高效，但不適于大體積樣本分離[11]。外泌體分離商業試劑盒主要用于尿液、血清、腦脊液和細胞培養基等無細胞樣本，并提取所獲外泌體RNA進行miRNA檢測和表達譜分析[11]。流式細胞分選法純度高，能特異性分選某種細胞來源的外泌體，適合后續功能學研究，同樣不適于大體積樣本的分選[7]。根據實驗目的以及成本考慮，研究人員應根據實際情況選擇最適宜的分離方法。

2 腫瘤外泌體標志物的應用

外泌體富含蛋白質、脂質和核酸分子，這些分子具有來源細胞的特異性，所以通過分析腫瘤細胞所釋放的外泌體分子特征就可部分反映其來源細胞表型及其生物學作用[3,12]。

2.1 外泌體蛋白標志物

現已發現多種腫瘤外泌體來源的蛋白類分子標志物。例如，乳腺癌、結腸癌和胰腺癌中均可檢測到磷脂酰肌醇蛋白聚糖1(glypican 1，GPC1)的表達，且與乳腺癌和結腸癌相比，GPC1對胰腺癌的早期診斷尤具價值[13-14]。前列腺癌患者血漿外泌體中凋亡抑制蛋白的表達增高則提示與腫瘤進展相關[15]。隨著蛋白組學技術的發展，研究發現腫瘤患者血液外泌體來源的蛋白標志物其診斷特異性和敏感性分別可達到95%和90%[6]。

2.2 外泌體miRNA分子標志物

miRNA是腫瘤外泌體檢測中較常見的標志物，到目前為止已鑒別了2 500余種miRNAs分子[16-18]。例如，血液外泌體miR-21的升高已被證實與胰腺癌、結直腸癌、肝癌、乳腺癌、卵巢癌及食管癌等多種腫瘤相關，可能與其參與腫瘤血管生成有關，研究表明肺癌細胞釋放的外泌體miR-21會通過STAT3依賴機制誘導周圍支氣管細胞血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)的產生，從而促進血管生成[19-20]。在食管癌中，miR-21還可以反映腫瘤的惡性程度，食管癌患者的miR-21水平與良性腫瘤患者相比急劇上升，上升的miR-21水平也與腫瘤的淋巴侵襲和轉移相關[21]。在膀胱癌患者中，尿液中的miR-21和miR-4454會顯著上調[18]。前列腺癌患者尿液外泌體中的miR-574-3p、miR-141-5p和miR-21-5p的表達水平顯著上升，表明這些miRNAs可用于前列腺癌的早期篩查[22]。膽管癌是惡性程度較高的消化系統腫瘤，發展隱蔽且臨床癥狀及體征出現晚，故給早期診斷帶來困難。高通量小RNA測序篩查了來自膽管癌和膽囊癌患者外泌體中一系列差異表達的miRNA，小RNA長度在正常個體、膽管癌患者和膽囊癌患者之間的分布存在顯著差異，膽管癌患者的外泌體中miR-96-5p、miR-151a-5p、miR-191-5p、miR-4732-3p顯著升高，而膽囊癌患者的外泌體中miR-151a-5p略有升高，為膽管癌和膽囊癌提供了一套新的生物診斷標志物[23]。

2.3 外泌體長鏈非編碼RNA分子標志物

當前，應用于胃癌診斷的血清生物標志物包括癌胚抗原(carcinoembryonic antigen，CEA)、癌抗原72-4(CA72-4)和CA19-9，然而這些分子的特異性和敏感性均較低[1]。因此，開發具有高特異性和敏感性的診斷早期胃癌的新方法至關重要[24]。胃癌相關的長鏈非編碼RNA1(lncRNA-GC1)在胃癌發生中起重要作用，但是外泌體lncRNA-GC1及其在胃癌中的潛在作用此前研究較少。研究證實，循環外泌體lncRNA-GC1具有作為早期檢測和監測胃癌進展的重要診斷價值，可作為無創生物標志物用于早期診斷和監測胃癌進展[25]。上述研究表明，腫瘤外泌體內的lncRNA分子在一些腫瘤相關疾病中同樣具有重要的診斷應用價值。

2.4 外泌體circRNA分子標志物

近年來，circRNA分子因獨特的環狀結構具備更穩定的生物學特性而備受關注。如circZKSCAN1在肝癌細胞中低表達且抑制肝癌細胞的增殖[26]，ciRS-7則被認為是非小細胞肺癌、結腸癌和胃癌等腫瘤的預后指標，其高表達與較高的臨床分期和較差的總體生存期相關[27]。目前已發現組織、血液和外泌體中的circRNA分子表達失調，而多種circRNA的聯合檢測會提高外泌體標志物的敏感性和特異性，甚至可達到90%左右[4,28]。

3 腫瘤外泌體與靶向治療

外泌體可作為納米載體來介導細胞間的信息傳遞，發揮信息傳遞作用的方式主要有：在細胞間轉移受體，通過配體-受體介導的方式作用于受體細胞，向受體細胞轉移功能蛋白，通過膜融合方式向受體細胞傳遞mRNA、miRNAs或轉錄因子等信息[29-32]。這些方式為腫瘤靶向治療開辟了新的途徑。例如，miRNA-130b-3p可通過p53信號通路靶向絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶1(SIK1)抑制髓母細胞瘤生長[16]。

外泌體廣泛分布于不同體液中，在體內有較長的半衰期，可利用電穿孔法、化學轉染法或共孵育等方式把治療性藥物裝載到外泌體中或將編碼某蛋白質的基因轉入到分泌外泌體的細胞中[33]。例如，合成的miR159可通過靶向編碼Wnt信號轉錄因子的轉錄因子7(TCF7)基因抑制乳腺癌細胞增殖，導致致癌蛋白MYC水平下降，異體移植乳腺腫瘤的動物模型也顯示口服植物源性miR159可顯著抑制腫瘤生長[34]。腫瘤細胞衍生的微粒(tumor derived microparticles，TMPs)可以用作化療藥物的載體，同時可作為免疫調節劑發揮抗腫瘤治療效應。近期，一項臨床研究顯示，腫瘤細胞衍生的含甲氨蝶呤的TMPs能夠有效緩解膽管癌患者發生膽道梗阻的癥狀[35]。綜上表明，天然或者工程化修飾的外泌體或可用于治療難治性腫瘤。

4 腫瘤外泌體與耐藥

現有研究發現多種外泌體來源的circRNA分子可能與腫瘤耐藥性相關，如has_circ_0004015高表達與酪氨酸激酶抑制劑耐藥相關，該分子可能通過與miR-1183結合靶向磷酸肌醇依賴性蛋白激酶1(PDPK1)基因，從而導致非小細胞肺癌對吉非替尼耐藥；circAKT3的高表達與胃癌對順鉑耐藥相關[36]。單細胞RNA測序確定了一種新的與癌癥相關的成纖維細胞(cancer associated fibroblast，CAF)亞群CD63+CAFs，分泌富含miR-22的外泌體，miR-22可以結合其靶標雌激素受體α(ERα)和磷脂酶及張力蛋白同源物(PTEN)，從而促進乳腺癌細胞他莫昔芬抗性，使ERα陽性的乳腺癌患者對他莫昔芬產生耐藥性并伴有轉移復發[37]。CAFs的EVs蛋白質組學分析確定了膜聯蛋白A6的重要作用，其通過激活β1整聯蛋白-局灶性黏附激酶(FAK)-YAP信號從而誘導細胞外基質中胃癌細胞網絡的形成和耐藥的發生。這些發現表明，耐藥性是由CAFs的EVs中的膜聯蛋白A6賦予，并通過結合常規化學療法抑制FAK-YAP信號傳導，這為抑制胃癌耐藥性提供了潛在途徑[38]。

5 腫瘤外泌體與腫瘤發生、發展

腫瘤細胞來源的外泌體可抑制T細胞誘導細胞凋亡，或抑制NK細胞促進腫瘤免疫[39-40]；能抑制抗原遞呈細胞的分化和成熟，從而抑制免疫反應[41]；可促進髓系抑制性細胞抑制免疫應答[42]；通過抑制T細胞增殖誘導調節性T細胞分化以協助腫瘤逃逸免疫監視，最終促進腫瘤的發生[43]。腫瘤相關巨噬細胞通過EVs傳遞缺氧誘導因子1α(HIF-1α)穩定的lncRNA，增強乳腺癌細胞的有氧糖酵解和細胞凋亡抗性，從而調控腫瘤細胞的代謝重編程[44]。另一項研究顯示，外泌體內circSHKBP1可通過調節miR-582-3p/HUR/VEGF途徑，抑制HSP90降解，促進胃癌進展，是探索進一步治療的絕佳候選者[45]。

研究還發現外泌體可促進血管生成，如心肌內皮細胞來源的外泌體能夠誘導細胞增殖及血管生成；黑色素瘤細胞來源的外泌體中miR-9通過抑制細胞因子信號轉導抑制因子5(SOCS5)的表達激活了JAK-STAT信號通路，從而促進內皮細胞的遷移和血管生成[46]。此外，腫瘤細胞來源的外泌體能促進腫瘤的轉移，還可轉運具有侵襲潛能的miRNA[47]，也可通過促進腫瘤細胞的上皮細胞間充質轉化來增強腫瘤的轉移性進展[12]。例如，外泌體可釋放轉化生長因子β(TGF-β)激活TGF-β信號通路，使成纖維細胞轉變為成肌纖維細胞，從而促進腫瘤的轉移[48]。除了細胞來源外泌體對腫瘤的影響外，細菌也是影響腫瘤發生發展的重要因素。最新研究顯示，具核梭桿菌是一種重要的結直腸癌相關細菌，感染該菌后可刺激結直腸癌細胞生成富含miR-1246/92b-3p/27a-3p和CXCL16/RhoA/IL-8的外泌體并遞送至未感染的細胞，促進腫瘤轉移[49]。

6 結語

由于外泌體分離方法存在差異化，檢測方法缺乏標準化以及樣本來源不一致等因素，研究報道的外泌體標志物檢測結果差異較大，常有矛盾之處[50]。因此，提高外泌體分離的提取效率是外泌體臨床轉化應用過程中值得關注和解決的首要問題。蛋白組學分析結果表明，血液外泌體中蛋白類標志物具備成為早期診斷標志物和鑒別原發性腫瘤的潛力[6]，外泌體中miRNA和circRNA分子的研究則為臨床建立特異性檢測Panel提供了依據。

外泌體傳遞細胞間遺傳信息的機制是引起腫瘤異質性的重要因素之一[51]。在腫瘤異質性環境中，外泌體可促進腫瘤的進展[52]，也可能通過信號傳導在治療方面產生腫瘤異質性[53]。此外，不同細胞生成的外泌體也存在異質性，Baietti等[54]發現沉默液泡分選蛋白4(VPS4)基因和腫瘤易感基因101蛋白(TSG-101)基因均可抑制乳腺癌MCF7細胞產生外泌體。因此，在選擇外泌體作為腫瘤診斷與預后監測的分子標志物時應考慮到腫瘤異質性的發生機制。

外泌體是機體來源的自然成分，能在體內穩定存在，經過特定修飾后具有靶向性，但也需關注外泌體的靶向性與耐藥性的關系。目前，天然或者工程化修飾的外泌體被視為一種理想工具用于治療一些難治性腫瘤。因此，外泌體在靶向治療中的應用前景值得期待和進一步挖掘。