傷口愈合過程中的干細胞動態變化

張慧聰，周文翹，章婷婷，胡常紅

(重慶醫科大學附屬口腔醫院全口義齒診療室/口腔疾病與生物醫學重慶市重點實驗室/重慶市高校市級口腔生物醫學工程重點實驗室，重慶，401147)

1 平衡狀態下的皮膚干細胞

皮膚損傷的修復需要一系列過程，包括止血、血管生成、再上皮化和細胞外基質重塑。這其中有許多皮膚干細胞的參與，包括毛囊間表皮干細胞、毛囊干細胞、毛囊漏斗部細胞、皮脂腺導管細胞等。這些細胞在傷口發生時，可以轉變為表皮干細胞，加速傷口的愈合并且促進皮膚附屬器的再生。譜系分析表明，皮膚中的新生毛囊是來自于毛囊干細胞小生境之外的表皮細胞，即毛囊間表皮，這表明傷口中的表皮干細胞具有毛囊干細胞的表型。毛囊間表皮由單層增殖性基底細胞和數層分化的非增殖性細胞組成。基底細胞可以作為終末分化的角質形成細胞的補充細胞。在小鼠模型中，基底細胞遷移到皮膚表面大約需要1周的時間，而補充整個毛囊間表皮需要大約1個月的時間[1]。早期的增殖動力學實驗表明，毛囊間表皮是由包含干細胞和祖細胞的小增殖單位維持。毛囊間表皮穩態是由一群定向祖細胞維持的，它們以隨機的方式平衡更新和分化[2,3]。但是，進一步的研究表明毛囊間表皮干細胞可以維持更加靜止的狀態，持續時間更長，并且可以產生循環更短，壽命更短的祖細胞[4]。

2 傷口愈合過成中的干細胞

皮膚組織具有替換凋亡細胞和治愈傷口的天然能力。這種能力存在于常駐干細胞當中，它們會在皮膚表皮和其附屬器受到來自外部環境的日常襲擊時，保持穩態并在受傷后進行自我更新，保存和修復[5]。在傷口愈合過程中，干細胞被激活并向不同的皮膚區域遷移。在修復過程中皮膚干細胞會瞬時失去譜系限制和空間限制，從而允許多個表皮干細胞發揮作用[6]。

毛囊干細胞位于毛囊凸起處，受傷后，毛囊干細胞會從毛囊凸起處迅速遷移到傷口，這將有助于表皮的修復。稀薄的毛囊干細胞在傷口愈合過程中具有很高的可塑性，與其在移植后的最終結果相似[7]。但是Cotsarelis[8]等人在小鼠受傷前將毛囊干細胞進行標記，然后建立皮膚缺損模型，之后觀察到毛囊干細胞遷移到傷口中心，但這種現象并沒有持續存在，最終只有3%的新生毛囊是被標記的。這說明了非毛囊干細胞是新生毛囊的主要來源。為了進一步研究再生毛囊的起源細胞，使用了Krt1-15-CrePR *;R26R轉基因小鼠，在受傷之前將大約70%的毛囊干細胞和50%的非毛囊凸起的表皮細胞標記，受傷后，大約一半的再生毛囊擁有表達lacZ的細胞（非毛囊凸起的表皮細胞的標記物），表明新的毛囊形成需要多種表皮細胞[8]。這些研究表明新的毛囊起源于毛囊干細胞生態位以外的細胞。

對毛囊間表皮干細胞的克隆分析表明，在小鼠尾巴皮膚損傷后，毛囊間表皮干細胞會被募集到傷口處，可以幫助表皮修復并持續長達35天[4]。但是，從長遠來看，毛囊間表皮干細胞群體僅在其起源區域長期存在，而不會在傷口愈合過程中其所遷移到的位置長期存在。這些觀察結果表明，在修復過程中，所有基底細胞均表現出一定程度的可塑性，基底細胞雖然可以在傷口發生時迅速遷移到傷口中心促進傷口的愈合，但基底細胞最終會保留其原始位置的記憶，而長期停留在原始位置。與毛囊干細胞相似，毛囊峽部表達Lrig1和Lgr6的干細胞在受傷后會動員起來，并且可能比毛囊干細胞活化得更快。但毛囊干細胞在再生過程中會迅速丟失，僅用作瞬時繃帶，使毛囊間表皮和毛囊峽部/漏斗部中的其他干細胞能夠長期維持修復狀態[9]。在表皮損傷后，來自凸起的干細胞被募集到表皮中，并以線性方式向傷口中心遷移，最終形成明顯的放射狀。值得注意的是，盡管凸起處的細胞也具有表皮表型，但多數在數周內從表皮中清除，這表明凸起處的干細胞通過對急性傷口產生短時的“瞬時擴增”效應以應對皮膚傷口的急性修復。無毛的皮膚（例如爪子的腹側或掌側）會比人的皮膚動力學愈合發生的更慢，這表明毛囊干細胞對于傷口的愈合是必不可少的[10]。總而言之，由創傷所產生的皮膚缺損可廣泛激活干細胞，使其呈現出不同于其穩態作用的特征。

3 傷口愈合過程中的干細胞的招募，遷移

通常表皮損傷后角質形成細胞增殖增加。有趣的是，在傷口邊緣未觀察到細胞的增殖，而是在傷口周圍，距邊緣0.5-1.5 mm處的增生區處觀察到增殖[11,12]。在傷口的最前沿，角質形成細胞不會增殖，而是以細胞片的形式遷移[11,12]。表皮細胞在受傷后12小時內開始遷移到傷口床中。受傷后的第二天，靠近傷口的毛囊間表皮細胞朝著傷口的方向呈細長形，并且處于靜止狀態，而遠處的細胞開始增殖。在這個區域之間，可以觀察到包含遷移細胞和增殖細胞的混合區域。在這個混合區域中，基底細胞向傷口拉長，并在該方向定向分裂。在表皮中，最初存在于前緣的細胞會平行于傷口的方向而被拉長，這表明細胞會主動遷移，但在傷后2-4天呈垂直方向，這可能是因為它們被后面的細胞推動和壓縮[11]。總而言之，這些觀察結果提示，在受傷后的前沿首先會發生細胞遷移，接著該區域中的細胞移位會觸發細胞的定向分裂。細胞增殖的增加本身可以產生更多的遷移細胞，這些遷移細胞隨后將前沿推向傷口中心。

受傷后的第四天，前沿細胞被壓縮并上調促進炎癥和再生的特定基因的表達。最前沿的細胞瞬時表達較高水平的基質金屬蛋白酶，促炎分子，控制細胞骨架的基因，微管和肌動蛋白，ECM配體和細胞粘附分子，例如整聯蛋白α5。前沿的恒定大小及其與傷口大小或皮膚區域的獨立性表明，控制標記物的表達信號是局部的，并可能在表皮內的細胞之間傳播。前沿可以充當瞬時支架，實現和諧的傷口愈合。通過分泌更高水平的蛋白質來控制ECM重塑和血凝塊溶解，傷口前沿可能會促進組織的再生朝傷口中心發展，并保護干細胞及其后代免受組織重塑[13]。

4 干細胞的種群動態

在穩態過程中，毛囊間表皮細胞在種群水平上不對稱分裂，以維持恒定數量的表皮細胞[14]。然而，在傷口愈合期間，需要增加細胞數量以補償丟失的細胞，直到重新上皮化的完成。可以通過增加對稱性更新或減少細胞分化的比例來實現過度更新，而不是過度分化。對K14-CreER（毛囊間表皮細胞和祖細胞）和Lrig1-CreER（漏斗干細胞）小鼠品系的克隆分析表明，單個毛囊間表皮或漏斗細胞（基底層和基底層以上）產生的標記細胞條紋向著傷口中心[11]。不管它們的最初位置如何，傷口似乎都能誘導少量干細胞的活化。

5 干細胞可塑性

當來自毛囊和毛囊漏斗部的干細胞在受傷時被募集到毛囊間表皮時，它們逐漸失去其最初的特性，而被重新編程為毛囊間表皮干細胞的命運[9]。然而造成這種可塑性的分子機制仍不完全清楚。在比較受傷的毛囊間表皮和穩態中的毛囊干細胞和毛囊間表皮干細胞的染色質分布時，受傷的毛囊間表皮在毛囊干細胞和毛囊間表皮干細胞之間表現出雜交特征，其中開放的染色質區域富含毛囊間表皮干細胞（Klf5）和毛囊干細胞（Sox9）轉錄因子。這個混合階段似乎確保了表皮屏障的正確重建[15]。這種混合狀態在修復過程中是短暫的，但在皮膚癌中持續存在的[15,16]。

受傷后分化的表皮細胞能夠恢復到干細胞狀態[17,18]，這在氣道上皮中也觀察到此類現象。但是，基底毛囊間表皮細胞的譜系追蹤表明，這些細胞在傷口愈合條件下不能再次回到基礎狀態[11,12]。相反，位于毛囊峽部的表達Gata6的細胞在穩態條件下會產生皮脂腺管，可在傷口愈合期間動員并向受損的毛囊間表皮遷移，并從分化的干細胞轉變為基底干細胞[19]。這種損傷不會在受傷后立即發生，因為基底細胞需要幾天的時間才能進入基底層并進行干細胞重編程[19]。與皮膚相似，腸道上皮中負責終末分化的細胞也可以恢復為祖細胞樣狀態，并在損傷后促進組織修復[20]。但是，需要腸道干細胞來確保電離輻射后的組織修復[21]，這表明，盡管定向祖細胞具有恢復干細胞的能力，但正常的組織駐留干細胞對于修復仍然至關重要。

創傷程度還可以影響細胞的可塑性。在相對較小的傷口中，皮膚重新上皮化而沒有重新形成毛囊，而在大傷口中則明顯出現了重新發育的毛囊。譜系追蹤證實，這些重新發育的毛囊不是源自毛囊干細胞，而是源自毛囊間表皮細胞[13]。這類似于胚胎發育過程中毛囊的形態發生。

6 展 望

在過去的十年中，已將皮膚傷口愈合的重點放在了細胞療法上，包括將各種細胞和生物活性因子摻入到支架中實現細胞-細胞和細胞-基質的相互作用，從而實現完整的組織再生。關于傷口愈合還應致力于借助尖端技術和分子信號傳導途徑的知識，進一步激勵研究人員將來開發有效的傷口護理療法。最近出現的新技術展現了傷口特異性治療方法的新途徑和策略。各種基因編輯工具，材料科學工程學和跨學科科學的共同努力，對改變當前情況具有巨大潛力。隨著生物醫學科學的新技術發展，皮膚再生和修復的持續改進正在以更快的速度進行。再生醫學及其相關臨床研究的未來趨勢可能會為新的治療方法打開大門，這可能會帶來傷口的無痛，快速和無疤愈合。