馬鈴薯提取物聯(lián)合放療通過增加凋亡抑制結直腸癌細胞增殖的研究

寶瑩娜 楊梅健 張繼紅 林宇 郁志龍 趙建國

研究發(fā)現(xiàn)，馬鈴薯提取物中含有豐富的抗腫瘤、抗炎癥、抗氧化成分，能夠抑制多種惡性腫瘤細胞的增殖生長，誘導凋亡發(fā)生，具有重要作用［1-3］。本研究通過采用內蒙古本地馬鈴薯提取物聯(lián)合放療，以人結直腸癌細胞株為研究對象，進行細胞學研究，探討馬鈴薯提取物聯(lián)合放療對結直腸癌細胞株的作用及機制。

材料與方法

一、材料

細胞系與主要試劑：人直腸癌LS-174T細胞株，購買于北納生物公司；馬鈴薯提取物由內蒙古蒙健生物科技有限公司提供；DMEM培養(yǎng)基、胰蛋白酶購于Gibco公司；胎牛血清購于Hyclon公司。CellTiter 96?AQueous One Solution Cell Proliferation Assay購于Promega公司。兔抗人GAPDH多克隆抗體購于杰美基因公司；兔抗人Caspase-3單克隆抗體、鼠抗人Bcl-2單克隆抗體購于Cell Signaling公司。Annexin V-FITC/PI細胞凋亡檢測試劑盒購于BD公司。

二、實驗方法

1.細胞培養(yǎng)：人直腸癌LS-174T細胞保持在高糖型DMEM完全培養(yǎng)基（含雙抗）中培養(yǎng)，并輔以用含10%的胎牛血清，將培養(yǎng)瓶放置于37℃、5%恒定濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，期間根據(jù)細胞生長情況予以換液、傳代或者凍存。

2.細胞照射：所有的照射均在內蒙古醫(yī)科大學附屬醫(yī)院放療科加速器2室照射，應用德國西門子直線加速器6MV-X線，源皮距SSD=100 cm，96孔板照射野：100 cm2，培養(yǎng)瓶照射野：25 cm2。照射野大小為每次需照射的細胞的培養(yǎng)瓶底總面積大小。

3.MTS檢測細胞增殖水平：將對數(shù)生長期的直腸癌LS-174T細胞消化離心后，加入1 mL DMEM完全培養(yǎng)基制成細胞懸液，用countstar細胞計數(shù)儀計算出細胞數(shù)，每孔接種5×103個細胞，取出適當細胞懸液加入適當體積DMEM進行稀釋后接種于96孔板中，置于37℃、5%恒定濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h使細胞貼壁后分別加入0 μL/孔、5 μL/孔、25 μL/孔、50 μL/孔濃度的馬鈴薯提取物，每個濃度設3個復孔，置于37℃、5%恒定濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 h使馬鈴薯提取物和人直腸癌LS-174T細胞充分作用。4 h后將96孔板在直線加速器下照射，不同濃度分別接受0 Gy/孔、2 Gy/孔、4 Gy/孔、8 Gy/孔劑量的射線照射，接受照射后將96孔板繼續(xù)放入培養(yǎng)箱分別培養(yǎng)24 h、48 h、72 h后每孔加入20 μL MTS溶液，繼續(xù)培養(yǎng)4 h后上機，酶免疫檢測儀490 nm波長測定各孔吸光度值。按公式計算抑瘤率：（對照組A490-實驗組A490）/對照組A490×100%。

4.流式細胞術檢測細胞凋亡：將試劑盒內10×Binding Buffer稀釋成1×Binding Buffer，用預冷的PBS將細胞清洗2遍，重懸后按照1×106個細胞/mL的細胞濃度于每組細胞中加入適量1×Binding Buffer工作液，每組吸出100 μL上述溶液（含1×105個細胞）到5 mL的培養(yǎng)管中，每組細胞加入5 μL FITC Annexin V和5 μL PI染液，輕柔吹打細胞，室溫（25℃）避光孵育15 min，加入400 μL×Binding Buffer到每個培養(yǎng)管中，1小時內上機讀取結果。

5.Western blotting檢測蛋白：將細胞分為ABCD四組，分別為：A組：8 Gy照射＋1 mL馬鈴薯提取物；B組：8 Gy照射；C組：1 mL馬鈴薯提取物；D組：未接受任何處理。四組樣品均在接受相應處理72 h后用配制的蛋白裂解液提取蛋白，上樣，跑膠，轉膜，封閉1 h，內參、Bcl-2及Caspase-3加入一抗稀釋液，4℃搖床過夜，洗膜（TBST清洗3次，10 min/次），二抗孵育，室溫，避光，搖床1 h，洗膜（TBST清洗2次，TBS清洗1次，10 min/次），上機掃描，使用ODYSSEY CLX近紅外激光成像系統(tǒng)讀取結果。

三、統(tǒng)計學方法

采用SPSS 22.0統(tǒng)計軟件進行分析。計量資料兩組數(shù)據(jù)比較進行t檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結 果

一、馬鈴薯提取物聯(lián)合放療能夠抑制結直腸癌細胞的增殖水平

馬鈴薯提取物單獨作用結直腸癌細胞株時，隨著提取物濃度在25 μL/mL后，對于細胞增殖的抑制作用逐漸增加，特別是在濃度為50 μL/mL作用72小時后對細胞增殖的抑制作用最顯著（t=28.6，P=0.001）（見圖1）。馬鈴薯提取物聯(lián)合放療共同作用于LS-174T細胞，使其增殖水平受到更大抑制，在給予相同劑量的放療作用時，當馬鈴薯提取物的濃度在25 μL/mL和50 μL/mL時對于增殖水平的抑制更加明顯。當放療劑量在8 Gy，同時馬鈴薯提取物濃度在50 μL/mL作用LS-174T細胞72 h后，對于結直腸癌細胞增殖的抑制水平達到最高（t=12.1，P=0.007，P＜0.05）（見圖2～4）。

圖1 馬鈴薯提取物單獨作用對結直腸癌細胞增殖的影響（注：當馬鈴薯提取物濃度達到25 μL/mL后，結直腸癌細胞的增殖抑制，特別是馬鈴薯提取物濃度在50 μL/mL作用72小時抑制最明顯，與對照組比較，*t=28.6，P=0.001）

圖2 馬鈴薯提取物聯(lián)合2 Gy放療對結直腸癌細胞增殖水平的影響（注：馬鈴薯提取物50 μL/mL聯(lián)合2 Gy放療作用于LS-174T細胞，在24小時、48小時、72小時，分別與對照組相比，均對細胞增殖抑制，*t=7.0，P=0.02，**t=68.0，P=0.00，***t=39.4，P=0.001）

圖3 馬鈴薯提取物聯(lián)合4 Gy放療對結直腸癌細胞增殖水平的影響（注：馬鈴薯提取物50 μL/mL聯(lián)合4 Gy放療作用于LS-174T細胞，在24小時、48小時、72小時，分別與對照組相比，均對細胞增殖抑制，*t=5.24，P=0.04，**t=17.5，P=0.003，***t=54.4，P=0.00）

圖4 馬鈴薯提取物聯(lián)合8 Gy放療對結直腸癌細胞增殖水平的影響（馬鈴薯提取物50 μL/mL聯(lián)合8 Gy放療作用于LS-174T細胞，在24小時、48小時、72小時，分別與對照組相比，均對細胞增殖抑制，*t=9.39，P=0.01，**t=5.31，P=0.03，***t=12.1，P=0.007）

二、馬鈴薯提取物聯(lián)合放療誘導凋亡發(fā)生

通過對馬鈴薯提取物濃度為50 μL/mL聯(lián)合8 Gy放療作用的LS-174T細胞進行流式細胞儀檢測，發(fā)現(xiàn)其凋亡水平顯著高于對照組（t=18.3，P=0.003）（見表1）。進一步檢測蛋白表達水平，證實在該組實驗細胞中，Bcl-2表達水平受到抑制，而Caspase 3表達水平升高（見表2）。

表1 馬鈴薯提取物聯(lián)合放療對結直腸癌細胞凋亡水平的影響（±s）

表1 馬鈴薯提取物聯(lián)合放療對結直腸癌細胞凋亡水平的影響（±s）

注：馬鈴薯提取物50 μL/mL聯(lián)合放療8 Gy與對照組相比較，凋亡比例顯著升高，*t=18.3，P=0.003

凋亡比例74.74±8.12*23.8±5.23 2.11±0.16 1.92±0.24組別馬鈴薯提取物50 μL/mL聯(lián)合放療8 Gy放療8 Gy馬鈴薯提取物50 μL/mL對照組

表2 馬鈴薯提取物聯(lián)合放療在蛋白水平對結直腸癌凋亡的影響（±s）

表2 馬鈴薯提取物聯(lián)合放療在蛋白水平對結直腸癌凋亡的影響（±s）

注：Werstern blotting結果顯示，與對照組相比較，馬鈴薯提取物聯(lián)合放療組Bcl-2表達顯著降低，Caspase 3表達顯著升高，*t=40.4，P=0.000，**t=10.1，P=0.001

0.0021±0.0001 0.0026±0.0002 0.002±0.0003組別馬鈴薯提取物50 μL/mL聯(lián)合放療8 Gy放療8 Gy馬鈴薯提取物50 μL/mL對照組蛋白質含量Bcl-2 0.0038±0.0001*Caspase-3 0.0079±0.0004**0.0047±0.0002 0.0065±0.0001 0.0071±0.0001

討 論

馬鈴薯（solanum tuberosum）在世界各國普遍食用，經(jīng)證實其含有大量優(yōu)質蛋白質、碳水化合物和礦物質，尤其是多種有益于人體健康的小分子化合物［4］。越來越多的研究表明，馬鈴薯中的化合物在抗氧化、抗腫瘤、抗炎癥等方面發(fā)揮著重要作用［5］。在前列腺癌研究中，發(fā)現(xiàn)馬鈴薯提取物中的酚酸和花青素能夠抑制前列腺癌細胞的生長并誘導細胞凋亡，并且通過誘導MAPK和JNK通路實現(xiàn)細胞增殖的抑制作用［6］。在宮頸癌研究，對于Hela細胞馬鈴薯生物成分能夠誘導S期細胞周期停滯，導致細胞增殖受到抑制［1］。肺癌研究中，馬鈴薯提取物α-茄堿，是一種在馬鈴薯中發(fā)現(xiàn)的配糖生物堿，對人肺癌細胞系具有細胞毒作用［7］。以上研究都證實了馬鈴薯提取物具有癌細胞生長抑制作用。放療是結直腸癌的主要治療方式之一，盡管目前結直腸癌的治療效果相對較好，但是局部復發(fā)和放射抗性仍是需要探索的挑戰(zhàn)。因此，本研究通過放療聯(lián)合馬鈴薯提取物兩者結合作用結直腸癌細胞，為未來結直腸癌放療增敏劑的研究提供實驗資料。

在本研究中，研究了不同濃度馬鈴薯提取物對結直腸癌細胞的抑制能力。研究表明，在馬鈴薯提取物濃度為25 μL/mL和50 μL/mL時細胞的增殖抑制顯著。當采用50 μL/mL馬鈴薯提取物作用72小時后明顯抑制細胞的生長。前列腺癌的研究中表明，隨著濃度增加，馬鈴薯提取物對前列腺癌細胞增殖的抑制作用增強［8］。

盡管在多種研究中證實，馬鈴薯提取物能夠誘導不同癌細胞的凋亡，但是這些研究都未與放療聯(lián)合。本研究表明，當馬鈴薯提取物濃度大于5μL/mL并與放療結合會降低結直腸癌細胞的生長水平。在相同劑量的放療作用下，給予50 μL/mL的馬鈴薯提取物分別在作用24 h、48 h和72 h表現(xiàn)出最高的生長抑制作用。另一方面，結直腸癌細胞在8 Gy放療聯(lián)合馬鈴薯提取物50 μL/mL濃度中生長72小時，其增殖顯著降低，這表明馬鈴薯提取物聯(lián)合放療對結直腸癌細胞增殖有較強的抑制作用。

為了進一步闡明機制，研究發(fā)現(xiàn)馬鈴薯提取物聯(lián)合放療能夠誘導細胞凋亡發(fā)生，進而抑制細胞的增殖，與馬鈴薯在其他癌細胞系中的促凋亡作用一致［8-9］。同時研究表明，放療聯(lián)合馬鈴薯提取物能夠使結直腸癌細胞中Caspase 3的激活和Bcl-2的失活。盡管如此，對于兩者聯(lián)合作用之后的機制仍需進一步深入研究。

綜上所述，本研究已經(jīng)明確馬鈴薯提取物聯(lián)合放療能夠顯著抑制結直腸癌細胞的增殖，并與細胞凋亡的激活有關。本研究提供了一種新的研究方向，未來可以通過馬鈴薯提取物來增強對結直腸癌的放射治療活性。