Eya家族蛋白在惡性腫瘤中的研究進展

楊俊美 王彩霞

佳木斯大學附屬第一醫院,黑龍江省佳木斯市 154000

Eya家族是重要的發育基因，首先在果蠅視網膜的發育過程中發現，參與人體多個器官的發育，在發育后表達下調，該家族基因主要有Eya1、Eya2、Eya3、Eya4。發育基因的功能異常是腫瘤發生的常見原因，也是許多腫瘤發生和發展中的普遍現象[1]。近年來Eya蛋白在許多腫瘤中均有研究，但表達情況不盡一致，本文旨在總結Eya家族蛋白在多種腫瘤中的表達情況及研究進展。

1 Eya家族蛋白的結構和功能

最初認為Eya是調控果蠅眼睛發育的關鍵基因，首先認識它是因為其對果蠅眼睛形成的重要作用和影響，其參與人體多個器官的發育過程，Eya1和Eya2在器官發育過程中廣泛表達于頭顱、胎盤、鰓弓和中樞神經系統。Eya3在鰓弓和中樞神經系統有表達，但是在頭顱、胎盤無表達，Eya4參與包括胸腺、甲狀腺、甲狀旁腺的發育，Eya1、Eya2和Eya3也參與眼睛的發育,Eya1表達于前房，Eya2表達于視網膜、鞏膜和視神經鞘，Ramos S等[2]研究Eya在具有分生組織卵巢的黑腹金絲猴的作用中，指出Eya也參與昆蟲的卵子發生，而且Eya突變阻礙了性腺的形成。Eya家族蛋白是從水生到人類的保守蛋白質，包含271個殘基的氨基末端區域和274個殘基的保守的羧基末端區域，稱為Eya結構域(ED)是保障其功能的重要結構,Eya的氨基末端有蘇氨酸磷酸酶，羧基末端有鹵酸脫鹵酶結構域，含有酪氨酸磷酸酶(Thr)。Eya基因具有調節細胞死亡和/或分化的作用，是視網膜決定基因網絡(RDGN)的重要成員之一，該基因網絡主要有Dach、Six和Eya，Dach作為腫瘤抑制因子，而Six和Eya作為癌基因發揮作用。在生物體中，Eya蛋白不僅是磷酸酶，還充當轉錄因子的角色，具有幫助同源盒家族基因Six轉錄的功能，Six缺乏內在轉錄活性區域，需要與Eya共同和結合形成轉錄復合體，來促進轉錄，在多個器官發育中起重要的作用。

功能上，Eya蛋白屬于核轉錄因子網絡成員之一。 Eya作為轉錄因子和轉錄激活因子可以與Six結合，與Six結合后可增加腫瘤干細胞(CSC)的數量，并誘導上皮—間充質轉化(EMT)。在Zhou Hengbo等[3]的研究中發現這種作用是通過激活轉化生長因子-β信號通路實現的。曾有學者認為，Eya家族蛋白的致瘤原因與血管的新生有關，具體如下：組蛋白H2A是核小體的亞基，核小體包含145bpDNA和八個組蛋白，兩個H2A，H2B，H3和H4，H2AX是幾乎所有真核生物均存在的一種組蛋白變體，DNA在正常情況下被包裹在組蛋白內，當致癌等損傷因素導致DNA損傷時，H2AX被磷酸化，產生γ-H2AX。磷酸化的H2AX是DNA雙鏈斷裂的證據，DNA損傷反應(DDR)是一種重要的細胞保護機制。DNA的錯誤修復會導致整個基因組的不穩定和癌癥的發生。DNA雙鏈損傷時，H2AX被磷酸化，募集MDC1, MDC1作為一個對接平臺，促進其他因子在DNA雙鏈損傷位點的聚集,DNA損傷后，MDC1把ATM依賴的ZNF506(辛指蛋白506)定位到病灶，ZNF506進而招募蛋白磷酸酶 Eya，導致H2AX在Y142處去磷酸化，進一步促進MDC1等下游修復因子的招募。Eya蛋白可以使H2AX的末端酪氨酸殘基去磷酸化的作用，產生高效DNA修復復合物，DNA損傷修復(DDR)可在有害的微環境中使內皮細胞存活，從而促進病理性血管生成。近年來，Eya家族蛋白在多種腫瘤中均有研究。

2 Eya蛋白在多種惡性腫瘤中起促癌作用

2.1 Eya1在肝細胞癌中的研究 肝細胞癌(HCC)是全球第六大常見癌癥，也是癌癥相關死亡的第三大常見原因，大量研究表明，乙型肝炎病毒及其產物、HBV整合、變異均可誘發肝細胞癌，肝細胞癌的診斷仍然對臨床醫生具有挑戰性，特別是對于甲胎蛋白低的患者，所以尋找新的有效標志物及治療靶點是極其迫切的。有研究表明Eya1可以促進肝細胞癌的轉移和侵襲，且與上皮間質轉換有關。

Eya1與含3B的纖連蛋白Ⅲ型結構域(FNDC3B)配位，FNDC3B也稱為FAD104(脂肪細胞分化因子104)，通過調節細胞粘附、生長和遷移，參與脂肪細胞和成骨細胞的分化和肺的成熟，Kong Deguang等人[4]Eya1在肝細胞癌研究中，通過Western blot分析表明，Eya1不僅增加了FNDC3B的豐度，而且促進了上皮間質轉化(EMT)樣表型的改變，如增加N-鈣粘蛋白和減少E-鈣粘蛋白的表達。提示Eya1激活FNDC3B促進肝癌細胞的遷移和侵襲。FNDC3B被鑒定為Eya1的一個新的下游靶點，這些發現為肝細胞癌新的腫瘤標志物的研究和癌細胞癌的治療又提供的新的理論線索。然而，有學者研究Eya4在肝細胞癌中的作用與Eya1的作用相反，Zhu Xiao-Xu等[5]研究Eya4在肝細胞癌中抑制腫瘤細胞的生長，并與MYCBP蛋白呈負相關，MYCBP是一種11-kDa蛋白，可與MYC結合并刺激轉錄的激活。MYC表達的增加可以促進MYCBP在細胞周期的S期易位到細胞核中，并影響細胞的增殖、分化和凋亡。他們認為，Eya4通過抑制MYCBP進而抑制肝細胞癌細胞系中的細胞增殖并誘導G2/M阻滯, Eya4通過在Ser552上對β-連環蛋白(β-catenin)進行磷酸化來減少β-catenin的核易位，從而抑制了β-catenin/ LEF1與MYCBP啟動子結合引起的MYCBP轉錄,在肝細胞癌中起抑癌作用。

2.2 Eya1在甲狀腺乳頭狀癌中的研究 甲狀腺乳頭狀癌(Papillary thyroid carcinoma，PTC)是起源于濾泡上皮的惡性腫瘤,Kong Deguang等人[6]研究發現，在甲狀腺乳頭狀癌組織芯片中，Eya1與Six1密切相關，功能分析表明，Six1通過將Eya1穩定在轉錄后水平進而增加了Eya1的表達，并且兩者在PTC中的高表達與高齡、淋巴結轉移和臨床分期有關，Six1依賴Eya1誘導轉錄激活因子3(Signal transducer and activator of transcriptinon3,STAT3)信號系統,而已知STAT3在多種腫瘤中作為癌基因起作用，促進腫瘤的進展。

2.3 Eya2在前列腺癌中的表達 前列腺癌(Prostate cancer,PCa)是男性第二常見的癌癥，是威脅全世界男性健康的重要腫瘤之一。Liu Zhongyuan等人[7]研究表明，Eya2 mRNA與前列腺癌的Gleason評分和淋巴結轉移呈正相關，并且Eya2降低了前列腺癌患者對多西他賽的敏感性和多西他賽誘導的細胞凋亡。Eya2的過表達上調了Bcl-2，基質金屬蛋白酶7(MMP7)和AKT磷酸化， Eya2可能通過AKT/Bcl-2軸調多西他賽的敏感性和線粒體膜電位，從而促進細胞增殖和侵襲以及癌癥的進展。

2.4 Eya2在人腦星形細胞瘤中的作用 星形細胞瘤是起源于神經上皮的惡性腫瘤，是神經系統較為常見的腫瘤，其易復發，預后差[8]，Wen Zhifeng等人[9]研究Eya2在星形細胞瘤中的作用時認為Eya2在Ⅲ～Ⅳ級星形細胞瘤(Astrocytoma)中的表達率高于Ⅰ～Ⅱ級。另外，將Eya2表達質粒轉染Eya2低表達的細胞系，發現其促進了細胞周期的進程，而Eya2的敲除抑制了細胞周期進程，并伴隨著細胞周期相關蛋白表達的變化，包括細胞周期蛋白D1(cyclin D1)和細胞周期蛋白E(cyclin E)。Eya2還正向調節細胞外信號調節激酶(ERK)活性和基質金屬蛋白酶9(MMP9)的表達。另外，使用抑制劑阻斷ERK信號，取消了Eya2對A172細胞侵襲和MMP9產生的影響。他們認為Eya2可能通過調節ERK信號通路，調節星形細胞瘤細胞的增殖和侵襲。

2.5 Eya2在人類乳腺癌中的研究 乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤，在乳腺癌中的Eya蛋白的研究中，Fu Jing等人[10]研究發現Eya2與microRNA相關，miR-30a通過與Eya2的30個非翻譯區結合來抑制Eya2的表達，Eya2可以增加c-Myc、cyclin A、cyclin D1和cyclin E的表達,他們發現miR-30a可以通過抑制Eya2的表達來抑制乳腺癌細胞的增殖和遷移。乳腺癌患者miR-30a表達下調，與乳腺癌患者Eya2表達呈負相關。眾所周知，表皮生長因子受體(EGFR)是調節腫瘤細胞生長、侵襲和轉移的重要調節因子，研究表明，Eya2是EGFR的下游調節器，具體通過缺氧誘導因子(HIF1α)下調腫瘤抑制因子micoRNA-338-3p(miR-338-3p)和激活Eya2蛋白來促進乳腺腫瘤的生長和轉移。

2.6 Eya2在人類肺癌中的研究 肺癌是全球癌癥相關死亡的主要原因。盡管在診斷和治療策略方面取得了進展，但肺癌的預后仍然很差。研究表明，Eya2通過調節miR-93來抑制磷酸酶和張力蛋白同源蛋白(PTEN)的表達，從而促進細胞增殖，且與預后較差相關。Anantharajan J等人[11]利用基因突變證明，肺腺癌細胞的遷移、侵襲形成和侵襲依賴于Eya2酪氨酸磷酸酶的活性，而生長和存活則與Eya2酪氨酸磷酸酶活性無關。Yuan Yuncang等人[12]研究發現miR-30a在肺腺癌A549細胞中的過表達抑制了細胞的遷移和侵襲，但對細胞增殖和細胞周期進程沒有影響，并通過雙熒光素酶報告實驗證明Eya2是miR-30a的直接靶點，兩者表達呈負相關,這與Fu Jing等人在乳腺中研究的Eya2和miR-30a的關系結果相似。

2.7 Eya2在人類骨肉瘤中的研究 骨肉瘤是一種由產生類骨質和未成熟骨的間充質細胞組成的惡性骨腫瘤。骨肉瘤是最常見的原發性惡性骨腫瘤，其好發年齡段為15～19歲，病灶多位于長管狀骨的干骺端，轉移率及致死率均較高。有學者通過生物信息學分析預測和雙重熒光素酶報告基因分析表明miR-219a-5p可以在其30 UTR處結合Eya2，顯著抑制了Eya2的表達。使用Transwell入侵測定法和刮擦傷口愈合測定法，沉默骨肉瘤細胞中的miR-219a-5p可以顯著誘導腫瘤細胞的侵襲和遷移，Eya2的下調逆轉了miR-219a-5p抑制劑對細胞侵襲和遷移的影響。他們的研究表明Eya2在骨肉瘤中表達上調，并且miR-219a-5p通過抑制Eya2表達來調節腫瘤細胞對OS細胞的侵襲性[13]。

2.8 Eya3在乳腺癌中的研究 在Vartuli RL等[14]的實驗中，Eya3的缺失降低了免疫活性小鼠的腫瘤生長，并且伴隨CD8+T細胞數量的增加，他們認為Eya3利用其Thr磷酸酶活性在pT58處去磷酸化MYC，從而使其形成穩定的形式,促進腫瘤的進展。而且，穩定的MYC使程序性死亡配體1(Programmed cell deth protein,PDL-1)在腫瘤的作用增強。而癌細胞可以利用PDL-1和程序性死亡分子(Programmed deth1，PD-1)使腫瘤細胞免受免疫系統的攻擊[15]。

3 Eya家族蛋白在部分腫瘤中出現低表達

3.1 Eya2在大腸癌中的研究 結腸癌是消化系統常見的惡性腫瘤，發病率和死亡率均居惡性腫瘤前列，且呈現出上升趨勢。鄭杰等人[16]在包括922例大腸癌病例的大隊列中評估了Eya2表達在大腸癌發生發展中的意義。采用免疫組織化學方法檢測大腸組織中Eya2蛋白的表達。研究Eya2在腫瘤組織和癌旁正常組織中的表達與大腸癌發生的關系。采用Kaplan-Meier和Cox模型分析影響大腸癌預后的因素。結果顯示Eya2在癌旁正常組織、腺瘤、原發腫瘤和轉移性大腸癌中的表達逐漸降低(均P<0.05)。他們認為在大腸癌組織中Eya2的表達普遍降低,Eya2高表達預示大腸癌預后較好。

3.2 Eya4在胰腺導管癌及食道癌中的研究 Mo Shi-Jing等人[17]在Eya4在胰腺導管癌(Pancreatic ductal adenocarci-noma，PDAC)的研究中，在PDAC細胞中過表達Eya2，在體外抑制了腫瘤的增殖和侵襲，在體內抑制了腫瘤的生長。PDAC細胞中Eya4的缺失在體外可促進腫瘤的增殖和侵襲，在體內可促進腫瘤的生長。機制上，Eya4通過絲氨酸/蘇氨酸特異性蛋白磷酸酶活性，使β-catenin在Ser675位去磷酸化，阻斷β-catenin核轉位，抑制Id2反式激活。有學者研究Eya蛋白在腫瘤中呈現低表達時由于其在腫瘤中呈現甲基化的狀態，而DNA甲基化是常見的一種表觀遺傳學狀態，在多種腫瘤中均有發生。Luo Mei等[18]關于Eya4的研究中發現，Eya2在大多數食管癌細胞系中呈低表達和高甲基化(85.7%，6/7)的狀態。他們用小發夾RNA敲除Eya4增加了腫瘤細胞體外遷移和侵襲的能力。曾有報道指出，在結腸癌、食管癌、非霍奇金淋巴瘤中存在Eya4臨近啟動子甲基化的現象，而在正常胃黏膜、食管中未出現Eya4甲基化現象。

4 總結與展望

綜上所述，Eya家族蛋白在腫瘤的作用復雜，在大部分腫瘤中呈高表達的狀態，與上皮間質轉化、腫瘤性血管生成、基質金屬蛋白酶、CD8+T細胞的數量及穩定細胞周期蛋白有關，促進了腫瘤細胞的侵襲與遷移，但在某些腫瘤中存在甲基化的現象，在腫瘤中表達降低，該家族成員在腫瘤中的重要作用有望對腫瘤的治療提供新的線索，為更多腫瘤患者謀福利。