牙齦卟啉單胞菌與不良妊娠結局的相關研究進展

齊 帥，林曉萍

牙周病是由于牙周病原菌和宿主免疫防御系統長期相互作用所致，有學者提出少數特定微生物引起的宿主口腔菌群的持續性失調是引起牙周組織破壞的主要原因，極低水平(細菌總數的0.01%)的牙齦卟啉單胞菌(Porphyromonasgingivalis,P.gingivalis)可誘發小鼠牙周炎，并造成局部細菌數量和菌群結構的顯著改變，因此P.gingivalis也被稱為“關鍵致病菌”[1]。P.gingivalis的毒力因子如脂多糖、菌毛、牙齦素等既能夠直接破壞組織，也可誘導宿主局部和系統性免疫應答產生間接免疫病理損傷。現有的證據表明牙周炎與先兆子癇(preeclampsia, PE)[2-3]、胎膜早破(premature rupture of membranes, PROM)[4]、胎兒宮內發育遲緩(intrauterine growth retardation, IUGR)[5]和早產低出生體重兒(preterm low birth weight, PLBW)[6]等多種不良妊娠結局(adverse pregnancy outcomes, APO)有關。現有的證據表明，P.gingivalis的存在可以部分解釋這種相關性，P.gingivalis能夠入侵牙周或母胎組織，造成全身和胎盤組織的免疫環境失調和氧化應激，引起子宮螺旋動脈重塑不良以及胎盤血管內皮功能障礙導致APO。

1 P.gingivalis對母胎組織的入侵

研究發現P.gingivalis不僅存在于牙周組織和牙菌斑，也存在于某些APO患者的母胎組織中。研究者對P.gingivalis的來源尚未達成共識，目前普遍認為P.gingivalis能通過泌尿生殖道經上行途徑到達胎盤單位，也可以利用自身的毒力因子如菌毛、牙齦素等粘附并破壞牙周組織，通過口腔血行播散到達母胎界面[7]。

多個研究為P.gingivalis在母胎組織的存在提供了證據。Amarasekara等[8]在PE孕婦的胎盤標本中找到了包括P.gingivalis在內的多種牙周致病菌，而對照組胎盤標本中未發現P.gingivalis。Parthiban等[9]發現PE孕婦胎盤組織的P.gingivalis顯著高于正常血壓孕婦，提示P.gingivalis可能與孕婦的血壓升高有關。除胎盤組織外，在PE患者的臍帶中也檢測到了P.gingivalis的存在，Vanterpool等[10]為確定P.gingivalis在胎盤和臍帶中的位置是否與不同妊娠并發癥有關，用免疫熒光法在胎盤和臍帶樣本的連續切片中檢測P.gingivalis抗原，結果顯示P.gingivalis在臍帶中的存在與PE顯著相關，而胎盤絨毛間質中的P.gingivalis只在早產孕婦體內檢出，這些研究揭示了P.gingivalis對母胎組織的入侵行為。有研究從另一角度揭示了P.gingivalis與APO的相關性，研究者們發現PLBW和PE患者口腔牙周袋內的P.gingivalis水平顯著高于健康孕婦[11-12]，但是這些研究并未同時檢測這些孕婦胎盤組織中是否也存在P.gingivalis。

2 P.gingivalis影響子宮螺旋動脈重塑

妊娠過程受多種細胞、細胞因子和信號轉導通路的調控，絨毛外滋養層細胞(extravillous trophoblast cell, EVT)在其中扮演重要角色，在妊娠中期由滋養層細胞分化而成的EVT向子宮血管內皮和肌層的侵襲是子宮螺旋動脈重塑的關鍵，這一步驟可以改善胎盤的血供，對胎盤的發育和成熟至關重要。EVT的功能受損一方面會導致子宮螺旋動脈重塑不足，胎兒因血供不足而營養不良甚至死亡。另一方面，血流灌注不足的胎盤能夠釋放大量促炎細胞因子、抗血管生成因子和游離細胞DNA等進入母體循環，擾亂母體內皮功能導致全身炎癥反應，這被認為是孕婦PE的主要原因之一[13]。

多個研究顯示P.gingivalis能夠通過不同信號通路誘導EVT凋亡。P.gingivalis可通過激活ERK1/2及其下游效應因子誘導EVT的G1期阻滯和細胞凋亡[14]，該過程還可以通過P.gingivalis激活JNK和p38信號通路實現[15]，Ren等[16]認為EVT凋亡與P.gingivalis激活ERK1/2和p38信號通路誘導IL8和IFN-γ分泌有關。此外，Guo等[17]在體外用P.gingivalis(ATCC33277)感染人EVT細胞(HTR-8/SVneo細胞)，發現HTR-8細胞體積收縮并逐漸失去細胞連接，隨著時間的推移，感染細胞的細胞骨架變得更密集，細胞核變得更小。感染后的HTR-8細胞凋亡百分比顯著提高，PI3K/Akt信號通路對該過程具有抑制作用。

除引起細胞凋亡外，P.gingivalis還能夠影響滋養層細胞的侵襲能力，將HTR-8/SVneo細胞接種于含或不含P.gingivalis的人工基膜上24 h，該細胞的侵襲能力呈現出依賴于P.gingivalis劑量的抑制現象[18]。P.gingivalis對子宮螺旋動脈重塑的影響還具有菌株依賴性。Phillips等[19]在P.gingivalis感染的小鼠模型中發現，僅P.gingivalisA7436感染的小鼠出現子宮螺旋動脈重塑不足，而P.gingivalisW83感染組未發現這一表現。

3 P.gingivalis與免疫細胞

在妊娠早期，子宮/蛻膜自然殺傷細胞(uterine/decidual natural killer cells, uNKs/dNKs)是蛻膜間質中的主要細胞，其次有巨噬細胞、中性粒細胞、T細胞等。這些細胞浸潤蛻膜并聚集在滋養層細胞周圍協助它們正確地侵襲子宮螺旋動脈。

研究發現，在孕早期P.gingivalis能夠降低CD56+dNKs的數量并提高CD16+dNKs和CD206+蛻膜巨噬細胞的數量，這種比例的改變可能干擾滋養層細胞遷移和重塑螺旋動脈，并最終導致胎兒發育不良[13]。還有研究發現中性粒細胞在胎盤缺血引起的大鼠高血壓中扮演重要角色[20]，目前尚無P.gingivalis與中性粒細胞作用導致APO的直接證據，但有研究發現P.gingivalis的脂多糖能依賴PI3K、JNK和p38MAPK通路誘導中性粒細胞釋放抵抗素，而抵抗素與孕婦PE有關[21-22]。另一方面，P.gingivalis的膜泡具有孔蛋白樣活性可將中性粒細胞表面的電位去極化，抑制其吞噬作用，這可能是P.gingivalis能夠在生殖器官內持續存在的原因之一[23]。

P.gingivalis對CD4+T細胞亞群和相關細胞因子平衡的影響可能也是導致APO的原因之一。文獻顯示與健康孕婦相比，PE孕婦臍帶血中Th2和Treg細胞水平顯著降低[24]，血液和胎盤標本中Th1和Th17型細胞因子TNF-α、IL-6的水平顯著升高，而Th2型細胞因子IL-4、IL-10水平顯著降低[25-26]。早產患者也同樣存在類似的現象，且TNF-α、IL-6、IL-10水平與新生兒出生體重呈顯著負相關[27]。產生這種變化的原因之一可能是P.gingivalis感染，Lin等[28]發現在小鼠模型中，局部的P.gingivalis感染可以傳播到胎盤，并且與胎盤環境由Th2型體液免疫向Th1型細胞免疫的轉變以及胎兒生長受限或死亡有關。Ao等[29]發現牙髓感染P.gingivalis的小鼠與對照組相比，血清中TNF-α、IL-6、IL-17、IL-1β(Th1和Th17型細胞因子)水平顯著增高，分娩時間顯著提前，且在胎盤組織中發現了P.gingivalis存在以及不同程度的胎盤病理性破壞。

4 P.gingivalis、氧化應激和APO

氧化應激(oxidative stress, OS)被認為是活性氧(reactive oxygen species，ROS)的產生和清除作用不平衡導致的，在生理條件下，活性氧能夠參與細胞信號通路并促進正常的細胞發育過程，然而病理性的OS狀態伴隨的局部胎盤組織的ROS和抗氧化劑平衡失調可能與多種不良妊娠反應有關。

OS是牙周炎和系統性疾病相關聯的病理生理機制之一，致病菌如P.gingivalis在其中發揮了重要作用，P.gingivalis能夠激活某些通路影響靶細胞內線粒體和內質網的功能，造成局部或全身活性氧如過氧化氫(H2O2)、羥基自由基的過量產生。研究發現，牙周炎患者的臨床附著喪失越大，血清活性氧代謝物水平越高，該水平與血清的P.gingivalis抗體滴度呈正相關[30]，與牙周健康者相比，牙周炎患者外周血的中性粒細胞OS增強，在P.gingivalis的刺激下產生的過氧化物也顯著增多[31]。在體外實驗中P.gingivalis的脂多糖還能引起人類牙齦成纖維細胞的線粒體數量增加、活動增強，從而產生大量H2O2進入機體循環內[32]。

目前PE發生的具體分子機制尚不清楚，但是OS被認為在PE患者的內皮功能障礙和系統性血管收縮中起重要作用。一項病例對照研究顯示，相較于健康孕婦和未懷孕婦女，PE孕婦的血漿和胎盤組織中抗氧化劑水平顯著降低，OS代謝反應顯著增強[33]，在早產婦的尿液中也發現8-異前列腺素F2α(OS標志物)顯著增高[34]。相關文獻顯示，ROS可以作為胞內的第二信使刺激胎盤細胞分泌一系列促炎細胞因子，導致廣泛性的胎盤血管內皮功能障礙[35-36]。過度的OS狀態還能影響胎盤滋養層細胞的凋亡、增殖和遷移行為。例如H2O2是細胞OS級聯反應的關鍵因子，早期PE患者通常伴隨循環內H2O2增加，而Murata等[37]的體外研究發現H2O2能促進人類滋養層細胞凋亡并抑制其增殖。研究還發現OS可能通過調節wnt/β-連環素信號通路影響胎盤滋養層細胞的侵襲參與PE發生[38]，結合上文推測，P.gingivalis對人滋養層細胞侵襲能力的影響可能是通過誘導機體的OS狀態而產生的。

5 結 論

綜上，近年來諸多研究揭示了孕婦APO與牙周炎和P.gingivalis的相關性，這一現象涉及到諸多細胞、細胞因子和信號分子的調節。回顧近年來的相關參考文獻，認為P.gingivalis對滋養層細胞侵襲和子宮螺旋動脈重塑的影響是這一過程的關鍵。P.gingivalis能夠以牙菌斑生物膜的形式固定于牙面和牙周組織，也能夠通過破潰的牙周袋內壁進入機體循環定植于母胎組織或直接經母體生殖道上行入侵。但無論經由何種方式，孕婦因此而產生的胎盤局部組織或全身OS狀態，以及P.gingivalis誘導的滋養層細胞凋亡才是PE、IUGR等APO發生的關鍵原因。進一步探究該過程中涉及到的具體細胞因子和分子通路將有利于各種APO的預防和治療。