重組人血管內皮抑制素注射液放療增敏作用機制的研究進展

王思雨，張大昕

(哈爾濱醫科大學附屬第一醫院腫瘤一科，哈爾濱 150001)

在腫瘤微環境(tumor microenvironment，TME)中，新生血管為腫瘤生長輸送氧氣、提供養分。1971年，Folkman[1]首次提出血管生成的概念，并指出阻斷腫瘤新生血管生成是遏制腫瘤發展和侵襲的有效策略。此后，抗血管生成藥物被廣泛應用于多種實體腫瘤中，血管靶向策略為抗腫瘤治療帶來新希望。內皮抑素是O′Reilly等[2]于1997年首次從鼠血管內皮瘤血清中發現并提取的一種內源性蛋白，具有顯著的抗血管生成作用和廣泛的抗腫瘤譜。而可溶性內皮抑素更具抗腫瘤活性，因此由我國自主研發的新一代抗血管生成藥物重組人血管內皮抑制素注射液(商品名:恩度)應運而生，2005年美國食品藥品管理局正式批準恩度作為復發和轉移非小細胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)的一線用藥[3]。目前，最新指南明確指出，在晚期NSCLC、轉移性鼻咽癌以及惡性黑色素瘤中，恩度可作為推薦使用的藥物[4-5]。但目前單用抗血管治療尚無長期生存率的報道，因為抗血管生成只能阻斷腫瘤發展的某條或某些通路，并不能殺滅腫瘤細胞?；诖?，人們開始將血管靶向治療與傳統放化療聯合起來進行研究。1995年，Teicher等[6]最先發現了抗血管生成治療對放療能起到加強作用。恩度能夠起到放療增敏作用，且不會增加對正常組織的毒性?，F就恩度放療增敏作用機制的研究進展予以綜述。

1 恩度的結構特點及抗腫瘤作用機制

1.1結構特點 內皮抑素是XVIII型膠原C端的一個20 000的片段，是最有效的內源性血管生成抑制因子之一，其一級結構中包含184個氨基酸，二級結構以β-折疊和環為主[2]。以往人們認為內皮抑素抗血管作用主要來自其中的鋅結合位點，但近年來有研究通過對內皮抑素進行變體后發現N端的二硫鍵環可能才是其抗腫瘤活性的關鍵結構[7]。恩度是我國科學家研發的一種重組人血管內皮抑制素，在天然內皮抑素的母體基礎上添加了9個氨基酸序列，使得內皮抑素的半衰期延長，穩定性提高，生物活性增強，由于其蛋白表達體系來源于大腸埃希菌，故解決了內皮抑素容易形成包含體的問題[8]。

1.2抗腫瘤作用機制

1.2.1作用于血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)/VEGF受體(vascular endothelial growth factor receptor，VEGFR) 機體對腫瘤新生血管的調控符合雙向調節的普遍規律，是正性調控因子和(或)負性調控因子相互作用的復雜過程。VEGF家族是促進新生血管形成最重要的正性調控因子之一，在腫瘤血管生成的調控中起主導作用，恩度能夠下調VEGF的表達水平并作用于VEGFR，使VEGF與血管內皮細胞的結合受阻，下調VEGF-VEGFR所介導的下游信號通路，進而抑制血管內皮細胞的活化、增殖與遷移[9]。

1.2.2作用于基質金屬蛋白酶(matrix metalloproteinase，MMP) MMP是一個大家族，主要功能為降解細胞外基質(extracellular matrix，ECM)中的蛋白成分。在TME中，腫瘤細胞與基膜表面的受體結合后分泌MMP等降解酶，降解ECM，腫瘤侵襲的組織學屏障被破壞，使腫瘤細胞得以沿基質空隙和基底膜缺損向周圍侵襲生長，而內皮抑素可以與MMP的前體結合形成穩定的復合物，阻止MMP活化，進而抑制腫瘤細胞的生長、侵襲[10]。Xu等[11]在H22肝癌小鼠模型中證實，應用恩度可顯著下調MMP-2和MMP-9水平，并使腫瘤微血管密度顯著降低。

1.2.3作用于核仁素 腫瘤細胞與內皮細胞的表面有復雜、相互作用的網絡，其中核仁素起重要作用，血管內皮細胞增殖與核仁素的磷酸化緊密相關[12]。內皮抑素可結合處于增殖狀態的微血管內皮細胞表面的核仁素，并被其轉運至細胞核內，抑制核仁素的磷酸化，從而抑制內皮細胞活化、增殖[13]。但由于核仁素只在血管內皮細胞上特異性表達，所以恩度對其他細胞(如平滑肌細胞、成纖維細胞)無作用[14]，因此安全性較高。

1.2.4誘導細胞凋亡 細胞凋亡是基因調控細胞的自主有序性死亡，是機體為維持內環境穩定而進行的程序化過程。Bcl-2家族是一個重要的凋亡調節蛋白家族，其低表達可促使細胞凋亡，而內皮抑素可以通過抑制Bcl-2的表達，誘導腫瘤血管內皮的凋亡，導致腫瘤新生血管的衰退[15]。也有研究認為，內皮抑素可與原肌球蛋白相互作用，破壞微絲的完整性，從而促進血管內皮細胞凋亡[16]。此外，有研究發現，內皮抑素不是血管特異性的，它可以直接作用于腫瘤細胞本身，抑制腫瘤細胞增殖并誘導其凋亡[17]。

2 恩度的放療增敏作用機制

2.1提供血管正常化時間窗 氧能促進活性氧類和自由基的產生，是已知的有效放射增敏劑。然而，缺氧在腫瘤中十分常見，在大多數實體瘤中，新形成的腫瘤微血管形態結構紊亂、基膜不完整，導致血流紊亂、淤滯，甚至出現反向流動、血管塌陷。這種異常的血管結構會導致血流量減少、血流灌注異質化，加重腫瘤內部缺氧。在缺氧的TME下，缺氧誘導因子1α(hypoxia inducible factor-1α，HIF-1α)和VEGF的表達均上調，誘導腫瘤新生血管生成，降低了放療的敏感性；同時，放療本身還可通過上調促血管生成因子(如VEGF、血小板衍生生長因子)和促存活因子(如Bcl-2、Bcl-xL)，誘導新生血管形成，并促進腫瘤細胞增殖，引起放療抵抗[18-19]。這使得放療與血管生成形成了一個不可避免的惡性循環。以往人們認為，抗腫瘤血管生成會加重腫瘤細胞缺氧，降低放療的效果，但Jain[20]指出，血管生成抑制劑可以修剪腫瘤新生血管，使其短暫地“正?；保⑹蛊涓行У剡M行氧氣和藥物輸送，從而提高常規療法的療效。血管正?；o放療提供了一個窗口期，在這個窗口期內腫瘤微血管的功能與正常血管接近，缺氧細胞比例降低，腫瘤細胞對放射線敏感性提高[21]。另有學者研究發現，惡性腦膠質瘤患者接受Cediranib(AZD2171)治療后血管的正?；癄顟B可能是可逆的[22]，提示時間窗的選擇在聯合治療中至關重要。郝美麗等[23]通過對小鼠胃癌移植瘤模型的研究，發現恩度治療后腫瘤血管正?；臅r間窗為第5～9天，且該時間窗內微血管密度降低，Ⅳ型膠原表達增多，HIF-1α表達減少，可見恩度在該時間窗內可使腫瘤微血管減少、基膜完整、周細胞覆蓋率增加、TME的缺氧狀態得以改善，從而打破放療與血管生成的不良循環，起到放療增敏效應。蔣曉東[24]在肺癌患者使用恩度治療后第1、5、10天進行缺氧顯像和CT灌注成像，結果發現，血流量呈現先升高后降低的“倒U型”趨勢，并在第5天達到峰值。楊振東[25]在臨床試驗中應用超聲造影技術評價了恩度誘導鼻咽癌患者腫瘤血管正?；?，結果顯示，出現血管正?；ㄐ蔚臅r間窗約為應用恩度后5 d內，與動物實驗的正?；瘯r間窗基本吻合。

2.2下調促血管生成因子水平 VEGF、HIF-1α是已知的可由放療誘導、引起放療抵抗的促血管生成因子。HIF-1α是一種在缺氧條件下穩定表達的核轉錄因子，激活后可轉錄下游的多種基因，使組織、細胞適應缺氧環境。在腫瘤組織中，HIF-1α可維持腫瘤細胞及內皮在缺氧環境中內環境的穩定，使其免受放療損傷，加速腫瘤新生血管形成，降低腫瘤組織對射線的敏感性[12]，而抑制VEGF、HIF-1α可提高放療的療效。劉亮等[26]的體外研究表明，恩度能增強VEGFR-2信使RNA高表達的NSCLC細胞系Calu-1細胞的放射敏感性，推測其作用機制可能為恩度抑制了VEGFR-2的表達，通過磷脂酰肌醇-3-激酶/蛋白激酶B與促分裂原活化的蛋白激酶/胞外信號調節激酶兩條非缺氧途徑下調HIF-1α的表達，從而增強細胞的放射敏感性。楊曉軍等[27]在一項針對Ⅲa期肺癌患者的研究中，通過對腫瘤組織進行基因檢測，發現高表達VEGFR-1和VEGFR-2的患者在應用恩度后復發轉移率降低，提示VEGFR的表達水平可能是恩度輔助治療潛在的療效預測因子。另有研究顯示，恩度能夠降低小鼠肝癌組織中VEGF、HIF-1α、MMP-2、MMP-9以及白細胞介素-17的水平[11]，而VEGF、HIF-1α、MMP-2、MMP-9以及白細胞介素-17等可以不同的方式參與細胞增殖、轉移，刺激新生血管形成。這個過程是否與放療誘導有關目前尚無定論，可能是恩度聯合放療增敏的機制之一，有待于進一步研究。

2.3使細胞周期阻滯于放療敏感期 細胞周期進程為：DNA合成前期(G1期)→DNA合成期(S期)→DNA合成后期(G2期)→分裂期(M期)。處于不同細胞周期時相的腫瘤細胞對放射線的敏感性存在差異，一般認為，G2/M期的細胞對放療最為敏感，G1期次之，S期敏感性最低[28]。腫瘤細胞在缺氧的TME中G2/M期時間顯著縮短，故腫瘤細胞表現出對放療的抗拒[29]。因此，如果可以調整腫瘤組織中細胞所處的細胞周期狀態，使其同步化于對射線敏感的時相，就能夠增加細胞的放療敏感性。Zhang等[30]應用流式細胞術評價了應用恩度對人肺癌A549細胞的作用，結果發現，給藥后處于G2/M期、S期的細胞增加，且以G2/M期增加為主，由此推測，恩度可能是通過使細胞阻滯于G2/M期，增強了A549肺癌細胞的放射敏感性。Liu等[31]進行的食管癌細胞Eca109體外實驗結果表明，恩度與放療聯合組G2/M期、S期細胞的百分率較對照組和放療組顯著降低，而G0/G1期細胞百分率顯著升高，放療組與聯合組的細胞凋亡率均高于對照組，且聯合組高于放療組，故認為恩度可能通過細胞周期阻滯誘導細胞凋亡的方式增加放療的敏感性。此外，處于對放療不敏感時相的腫瘤細胞的存活是放療后腫瘤復發的根源，恩度通過非特異性抑制細胞增殖，作用于處于S期的腫瘤細胞，從而達到減輕放療抵抗、抑制腫瘤生長的目的[32]。

2.4誘導內皮細胞和腫瘤細胞凋亡 Folkman[14]在關于惡性腫瘤的“二室模型”中提出，內皮細胞和腫瘤細胞兩種群體可相互永久性誘導各自與腫瘤惡性程度相關的表型表達，使腫瘤細胞持續擴增，惡性程度也隨之增加。放療可引起DNA單鏈或雙鏈斷裂，通過使細胞停滯在特定細胞周期內(或細胞崩解)起到殺傷內皮細胞和腫瘤細胞作用；而放療引起細胞DNA單雙鏈斷裂后，細胞會激活細胞周期檢查點使細胞發生細胞周期停滯，為DNA的修復提供時間[33]。恩度可能通過抑制細胞DNA損傷修復、誘導細胞凋亡來協同放療殺傷，具體機制很可能是多通路、多靶點的，有待進一步研究明確。蔣曉東[24]通過對A549肺腺癌裸鼠移植瘤的研究發現，恩度與放療聯合組的腫瘤細胞凋亡增多，腫瘤退縮早，較單獨治療組具有更好的腫瘤控制。Meng等[34]的研究表明，恩度可在多種NSCLC細胞中抑制高遷移率族蛋白B1的表達與釋放，從而抑制腫瘤細胞的增殖。Yan等[35]研究發現，內皮抑素還可抑制DNA-蛋白激酶C，影響其磷酸化，導致DNA損傷累積，從而誘導多種腫瘤細胞的凋亡；體內試驗發現，恩度與人凋亡相關新基因DESI2(desumoylating isopeptidase 2)聯用治療較單一治療可更顯著地抑制腫瘤生長，并有效延長荷瘤小鼠的存活時間。

2.5改善TME TME是一個時刻發生動態變化的復雜環境，其免疫狀態與腫瘤的發展密切相關。研究表明，恩度可以顯著降低腫瘤組織中骨髓來源抑制性細胞、M2型腫瘤相關巨噬細胞的數量，增加成熟樹突狀細胞和M1型、M2型腫瘤相關巨噬細胞數量，并可使更多的CD8+T淋巴細胞浸潤到腫瘤組織中，使腫瘤內部抑制免疫應答的微環境逆轉為促進免疫應答的微環境[36]。程序性死亡受體1是近年來發現的一種重要的免疫抑制分子，能夠抑制T細胞炎癥活動，促進免疫逃逸。Wu等[37]研究表明，抗程序性死亡受體1聯合恩度能夠顯著抑制Lewis肺癌小鼠模型中的腫瘤生長，這種協同效應可導致VEGF表達顯著下調、白細胞介素-17和轉化生長因子-β1水平降低、骨髓來源抑制性細胞積聚減少以及CD8+T淋巴細胞抑制狀態逆轉，而腫瘤細胞凋亡和磷脂酰肌醇-3-激酶/蛋白激酶B/哺乳動物雷帕霉素靶蛋白介導的自噬均上調。腫瘤血管正常化與免疫重編程之間相互調節形成一個加強環路，誘導強效而持久的抗腫瘤免疫[38]。放療除了直接殺傷細胞外，還具有促進局部和全身控制實體腫瘤的潛力，是一種有效的免疫調節劑。放療可將細胞毒性T淋巴細胞募集到TME中，從而調節免疫反應，改變TME的免疫抑制狀態[39]，這與恩度對TME的影響類似，因此推測恩度對TME的逆轉可能也是其放療增敏作用的機制之一?？寡苌芍委熍c放療、免疫治療聯合是目前最有前景的研究方向之一，期待進一步的機制揭示為治療惡性腫瘤提供新策略。

3 小 結

恩度對放療的增敏作用很可能是一個多通路、多步驟、多靶點的復雜過程。盡管近年來抗血管生成與放療聯合應用的研究成果日漸增多，但大多仍處于臨床前期和臨床研究階段，且缺乏高級別的循證醫學證據。2018年的一項臨床研究顯示，持續輸注恩度聯合放化療雖然能獲得更好的總生存期，但并不能延長中位無進展生存期[40]。未來，應進一步明確聯合治療的最佳時序與時機、選擇給藥的最佳途徑[41]、尋找可用于臨床的血管正?；飳W標志物、建立更為可靠的療效預測手段和不良反應評價體系以及明確可能受益的病種、優勢人群等。