CTCs監測腫瘤轉移機制及在結直腸癌診療中的應用

程煌榮，鄭勇斌

(武漢大學人民醫院胃腸外科，武漢 430060)

近年來，隨著國民健康體檢意識的提高以及臨床診療技術的發展，許多早期腫瘤患者得到有效診治。據統計，2017年全球惡性腫瘤的致死病例高達2.335億，其中結直腸癌899.6萬例，位居第二[1]。腫瘤發生遠處轉移是晚期腫瘤患者致死的主要原因，約90%的患者死于腫瘤轉移，因此明確腫瘤遠處轉移的機制是改善腫瘤患者預后的關鍵[2]。學者們不斷嘗試著對腫瘤轉移的機制提出猜想并予以驗證，如最初的種子-土壤學說以及隨后陸續提出的轉移瀑布學說、腫瘤干細胞理論、細胞擠出假說等，但目前仍無公認統一的解釋。隨著細胞分離、采集和基因測序等技術的成熟，液體活檢在腫瘤領域被廣泛應用，作為液體活檢主要檢測對象之一的循環腫瘤細胞(circulating tumor cells，CTCs)在乳腺癌、結直腸癌等腫瘤臨床應用中顯示出巨大價值，因此CTCs與腫瘤轉移的潛在聯系成為研究的熱點。現通過分析腫瘤轉移的一系列過程、CTCs的上皮-間充質轉化(epithelial-to-mesenchymal transition，EMT)、血小板和腫瘤微環境對CTCs形成、存活、轉移的調控，對CTCs在腫瘤遠處轉移中的作用機制研究進展予以綜述，探討CTCs在腫瘤血行轉移中可能的作用機制以及對結直腸癌的臨床指導作用，以期為腫瘤轉移的進一步研究和結直腸癌診療提供參考依據。

1 CTCs和腫瘤血行轉移

CTCs指從原發腫瘤或轉移灶自發或被動地脫落后侵襲血管并進入血液循環，逃離宿主免疫殺傷后在遠處部位形成病變的腫瘤細胞[3]。CTCs在外周血中非常稀有，每10億個正常血細胞才可能發現1個CTCs，稀有性限制了CTCs在臨床上的應用[4]。近年來，由于細胞富集技術敏感性的提升，CTCs在腫瘤領域的相關研究不斷涌現，Cristofanilli等[5]通過研究乳腺癌患者外周血CTCs水平，首次提出CTCs可能是惡性腫瘤患者無進展生存期與總生存期的有效標志物。Sastre等[6]對127例試驗對象進行CTCs檢測發現，入組結直腸癌患者的CTCs陽性率為36.2%，與腫瘤的臨床分期顯著相關(Ⅱ期為20.7%、Ⅲ期為24.1%、Ⅳ期為60.7%，P<0.005)。隨后研究表明，CTCs檢測可以評估腫瘤患者轉移和復發風險[7]，美國臨床腫瘤協會將CTCs納入新型腫瘤標志物，美國癌癥聯合委員會也將其納入乳腺癌TNM分期系統中。CTCs在腫瘤早期診斷、療效監測、預后評估方面的潛在價值，促使研究者更加關注CTCs導致腫瘤轉移的機制。

CTCs以血液為“載體”，并以血行轉移方式向遠處播散，大致過程如下：①局部浸潤與血管內滲：腫瘤細胞從原發病灶脫落，突破腫瘤周圍組織、降解基質、穿過血管基膜，進入血管；②遷移：腫瘤細胞進入體內循環系統后逃避免疫監視，以CTCs的形式運輸至全身；③播散腫瘤細胞形成：停留在毛細血管床的CTCs與血管內皮細胞相黏附，穿過血管壁進入組織或器官，成為播散腫瘤細胞；④定植、增殖形成轉移灶：播散腫瘤細胞在轉移部位增殖形成轉移灶；⑤轉移灶的二次轉移：“遷移”是腫瘤在遠處轉移過程中的關鍵環節，CTCs通過細胞黏附分子黏附于血管內皮是遷移機制的基礎。然而，目前CTCs參與腫瘤轉移的具體機制尚未完全闡明。

2 CTCs在腫瘤轉移過程中的機制

2.1EMT的促腫瘤細胞轉移作用 EMT是腫瘤轉移性生長的必要條件。第一，EMT過程是腫瘤細胞表型變化和轉移級聯所必需的。多種生長因子(如表皮生長因子、轉化生長因子-β)、細胞因子和轉錄因子(如鋅指蛋白轉錄因子、鋅指E-box結合同源框1和2、轉錄因子4、叉頭框蛋白C2)的活性在腫瘤惡性進展過程中失調，腫瘤細胞表型從上皮表型轉變為間充質表型，表現為上皮蛋白(閉合蛋白、細胞角蛋白、上皮鈣黏素等)下調、間充質蛋白(纖維連接蛋白、波形蛋白、神經鈣黏素等)上調、apico-基底極性以及細胞肌動蛋白骨架重塑等，這些變化使得緊密的細胞間連接(黏著連接、橋粒連接)被點連接代替甚至失去連接，丟失細胞間的黏附作用和上皮極性。在賦予腫瘤細胞干細胞特性同時，促進腫瘤細胞穿過組織間質向血管內滲成為CTCs，增加腫瘤細胞活動遷移的能力[8]。第二，EMT促進循環系統中CTCs的存活。誘導EMT的轉錄因子(如鋅指蛋白轉錄因子)一方面可促進腫瘤細胞產生侵襲性偽足，通過局部蛋白酶的蓄積以侵入細胞外基質，另一方面可以通過干擾正常的凋亡聯級抵抗衰老，保護CTCs免于失巢凋亡[9]。此外，還可以使CTCs對放療和化療產生耐藥性，從而有助于腫瘤細胞擴散、進一步提高CTCs的存活能力并在遠處形成增殖灶[10]。第三，EMT過程可逆。EMT發揮作用的信號通路大多數最終作用于上皮鈣黏素的表達調控[8]。當鈣黏素重新激活時可觸發EMT的逆過程：間充質-上皮轉化使腫瘤細胞恢復上皮表型，有助于腫瘤細胞在新的宿主微環境中存活，并獲得增殖和腫瘤轉移的能力[8]。

2.2血小板的促腫瘤細胞轉移作用 血小板是活躍的腫瘤細胞生長、外滲和轉移過程的參與者。血小板是骨髓造血組織成熟的巨核細胞產生的細胞質碎片，激活后釋放堿性成纖維細胞生長因子、血管內皮生長因子、表皮生長因子、血小板衍生生長因子、轉化生長因子-β、基質金屬蛋白酶等。

血小板是最早與血管內腫瘤細胞相互作用的細胞[11]，其促腫瘤轉移效應表現為：①血小板衍生的外泌體信使RNA和微RNA可以介導血小板與其他細胞類型之間基于基因的交流，從而調節靶細胞中蛋白質表達[12]。②血小板衍生生長因子、表皮生長因子等具有促有絲分裂原活性，可促進腫瘤新生血管形成；基質金屬蛋白酶、5-羥色胺、組胺等可收縮血管內皮細胞、降解血管基質、增加新生血管的通透性；轉化生長因子-β作為EMT重要誘導因素，通過腫瘤細胞中的核因子κB信號通路傳導，誘導、維持CTCs的EMT狀態，參與CTCs的形成[13]。

CTCs向遠處遷移時受到血流的剪切損傷以及免疫殺傷，而血小板對CTCs具有保護作用：①血小板與纖維蛋白原結合，并在整合蛋白、選擇素、黏附分子、腺苷三磷酸的作用下在CTCs表面包裹形成“血小板-纖維蛋白原-CTCs”復合物，發揮屏障保護作用[14]，并且CTCs通過分泌活化血小板的腺苷二磷酸、表達組織因子或釋放血栓形成和促凝微粒來增強復合物形成[15]。②血小板表面的主要組織相容性復合體Ⅰ分子被動轉移到CTCs表面，CTCs通過模擬宿主細胞逃避免疫清除[16]。③血小板通過細胞因子(如轉化生長因子-β)介導的自然殺傷細胞活化型受體NKG2D(natural-killer group 2,member D)下調抑制自然殺傷細胞的抗腫瘤活性，減輕對CTCs的免疫損傷[11]。

2.3腫瘤微環境的促腫瘤細胞轉移作用 腫瘤細胞與其周圍環境(如間充質細胞及纖維組織)一起構成了具有腫瘤特異性、適于腫瘤生長的腫瘤微環境。腫瘤微環境在促進腫瘤發生和腫瘤細胞轉移中的重要性已得到越來越多的認識。

快速分裂的突變細胞增殖速度超過了氧氣的供給速度，形成了腫瘤微環境的特征之一——低氧。在低氧環境下，一方面缺氧誘導因子-1α亞基降解受到抑制而大量聚集在腫瘤細胞核內；在共激活因子作用下，與缺氧誘導因子-1β亞基形成穩定的二極體復合物，激活下游基因表達、改變細胞能量代謝方式，并誘導毛細血管生成、加速腫瘤細胞分裂增殖、CTCs形成[17]；另一方面，缺氧不僅可抑制自然殺傷細胞的抗腫瘤作用和T淋巴細胞的毒性作用[18]，還招募免疫抑制細胞降低適應性免疫的抗腫瘤活性，在CTCs血行轉移過程中發揮免疫逃逸作用[19]。

腫瘤微環境的另一特征是低pH。糖酵解代謝增高是腫瘤微環境中酸性增加的直接原因[20]。微環境酸中毒對腫瘤細胞的局部浸潤與組織重塑有重要的調控作用：①酸性微環境可以釋放和激活蛋白水解酶(半胱氨酸、天冬氨酰等)，使細胞外基質降解促進腫瘤轉移[21]；②與細胞外環境相比，腫瘤細胞內的相對堿性環境對腫瘤細胞增殖有促進作用[22]；③酸性微環境增加細胞毒性，導致正常細胞發生凋亡和壞死，而腫瘤細胞由于獲得性適應得以存活甚至增殖[23]。隨著正常細胞死亡和細胞基質降解，腫瘤細胞可繼續擴散并侵入至正常細胞死亡以及基質降解后的空間，這種酸性微環境介導的腫瘤浸潤策略可促進惡性腫瘤細胞的局部浸潤和體內轉移。

3 CTCs在結直腸癌診療中的應用

3.1CTCs用于結直腸癌早期診斷及臨床分期 惡性腫瘤被認為是全球主要的死亡原因，其中結直腸癌發病率(6.1%)位居第四、死亡率(9.2%)位居第二[24]。因其發病初始癥狀隱匿，患者確診時多發展為中晚期，治療效果欠佳，因而結直腸癌早期篩查方法與良好的預后相關。CTCs作為一種新型前瞻性的腫瘤標志物，在患者出現相關癥狀或具有明顯影像學表現前，其異常升高具有警示作用。一項通過逆轉錄定量聚合酶鏈反應技術對735例Ⅱ期和Ⅲ期結直腸癌患者進行的大規模研究顯示，181例外周血檢測到CTCs異常增高[25]。此外，結直腸癌患者CTC陽性率TNM分期、原發腫瘤浸潤深度、淋巴結轉移呈正相關，故可結合CTCs檢測和TNM分期評估患者預后[26-27]。由此可見，CTCs檢測有利于早期發現腫瘤細胞、評估臨床分期，從而有助于提供早期抗腫瘤治療。

3.2CTCs用于結直腸癌療效評價與預后判斷 接受化療的結直腸癌患者，可以通過監測CTCs評價患者的治療效果。Tan等[28]監測9例結直腸癌伴遠處轉移患者化療期間CTCs的研究表明，CTCs水平可反映癌胚抗原無法顯示的患者化療反應和疾病進展情況。Cohen等[29]通過檢測430例轉移性結直腸癌患者在化療前和化療期間不同時間點的CTCs水平發現，化療3～4周后CTCs陽性患者的疾病進展率更高、治療前和治療中CTCs的數量是轉移性結直腸癌患者無進展生存期和總生存期的獨立預測指標。一項納入3 129例結直腸癌患者的Meta分析證明，CTCs的檢出表明結直腸癌患者的無進展生存期和總生存期較差，與檢測方法無關，CTCs的存在是患者生存預后不良的獨立預測因素[30]。在治療過程中，動態性檢測外周血中CTCs可以初步評價患者的治療效果及預后，有助于對腫瘤進行個體化治療。

3.3CTCs用于結直腸癌治療后復發的風險評估 遠處轉移目前仍是消化道腫瘤相關死亡的主要原因[2]。相當一部分接受根治性手術的早期患者術后5年內仍可發生復發、轉移。與傳統腫瘤標志物(如癌胚抗原、糖類抗原199)相比，CTCs對腫瘤復發更敏感[4]。一項對211例結直腸癌患者進行的前瞻性隊列研究顯示，術后CTCs陽性是腫瘤患者預后不良的獨立指標，與術前CTCs陽性相比，術后CTCs陽性患者術后3年內的復發風險更高[31]。對mFOLFOX化療后行根治性手術的Ⅲ期結直腸癌患者的研究發現，化療后持續CTCs陽性可能是預測復發和預后的潛在標志[32]，故對于此類患者的治療應引起重視。

4 CTCs臨床應用面臨的挑戰

CTCs檢測可用于結直腸癌等多種實體惡性腫瘤的非侵入性診斷，在腫瘤早期診斷、監測腫瘤轉移、腫瘤患者預后評估、判斷治療效果、確定耐藥機制等方面具有重要臨床價值。它可以“實時、動態”監控腫瘤的進展和遺傳異質性，這是實現精準醫學的重要環節。但其臨床應用實踐尚面臨以下挑戰。第一，CTCs檢測技術迥異導致檢測結果存在差異[33]。需要標準化的CTCs檢測流程(細胞富集、血液樣品處理與儲存等)，以減少各項研究之間的差異；第二，當前尚無法純化出全部類型的具有完整活性、高靈敏度的CTCs[34]，且現有富集方法也無法檢測間充質轉換細胞，仍需要優化富集檢測分離技術；第三，CTCs臨界值不明確。在使用CTCs計數評價腫瘤患者預后時，不同腫瘤的CTCs臨界值有所不同，即使同一腫瘤也沒有統一明確的臨界值，因而難以通過CTCs計數驗證結論的準確性；第四，當前CTCs單獨作為腫瘤的靶向標志物存在不足。在一些非腫瘤患者(如慢性肝炎或炎癥性腸炎)外周血中亦可檢測出低水平的CTCs，且尚缺乏CTCs優于影像學診斷的臨床證據；第五，目前CTCs檢測成本昂貴，尚無法大規模應用于臨床。

5 小 結

近年隨著CTCs檢測技術的不斷進步，作為腫瘤組織的替代物，CTCs成為結直腸癌、肺癌、乳腺癌等腫瘤相關研究的焦點。CTCs檢測作為全新的液體活檢技術，具有創傷小、可重復、動態監測等優點，在識別早期腫瘤患者、療效評價及復發風險評估等方面發揮著重要作用，具有較高的臨床價值。尋找一種公認、快速、低成本且敏感性和特異性高的提取CTCs完整信息的富集分離方法，對于CTCs在腫瘤診斷、療效評估及預后判斷等方面發揮更高的臨床價值，并為臨床診療提供全面且有價值的指導、助力腫瘤個體化治療和精細化管理具有重要意義；開展更多基礎實驗研究，并通過大規模、多中心的前瞻性臨床研究驗證CTCs的臨床應用價值，可為CTCs檢測的最佳臨床用途提供新的見解。