二肽基肽酶-4影響內皮細胞與血管生成機制的研究進展

陳鈺潔，鄭天鵬

(1.桂林醫學院，廣西 桂林 541199； 2.桂林醫學院第二附屬醫院內分泌與代謝科，廣西 桂林 541199)

糖尿病是一種常見的、以高血糖為特征的代謝性疾病，可導致多血管損傷。糖尿病血管病變是糖尿病最常見的并發癥，也是2型糖尿病患者死亡的主要原因，50%新診斷的2型糖尿病患者已經有大血管病變，75%～80%的糖尿病患者死于血管病變[1]。血管內皮功能障礙在糖尿病血管病變的發展中起著關鍵作用[2]。糖尿病患者長期的高血糖、胰島素抵抗、糖脂代謝紊亂、炎癥以及氧化應激等均可導致血管內皮細胞損傷，最終導致血管內皮功能障礙；內皮細胞是排列在整個血管系統內表面的單層扁平鱗狀細胞，通過釋放多種活性介質調節血管舒張、凝血和炎癥反應等功能[3]。而糖尿病血管內皮功能障礙的詳細機制目前仍在研究中。二肽基肽酶(dipeptidyl peptidase，DPP)4是一種蛋白酶，在調節胃腸源性肽激素的生物活性方面具有獨特的作用，對炎癥、免疫功能和細胞間信號轉導有顯著影響，對內分泌調節具有重要意義[4]。研究發現，可溶性DPP4能夠直接參與內皮功能障礙或免疫調節[5]。有研究已經證明了DPP4抑制劑在2型糖尿病高血管并發癥風險患者中的血管安全性[6]。同時，DPP4對血管內皮細胞和血管生成有一定的影響[7]。現就DPP4影響內皮細胞和血管生成機制的研究進展予以綜述。

1 DPP4概述

1.1DPP4家族和功能 據報道，編碼DPP4的人類基因定位于第2號染色體2q24.2位點[8]。DPP4是一個復雜基因家族的成員，其中幾個成員非特異性地截斷了許多與結構相關的肽，包括細胞因子、趨化因子、神經肽、激素和生長因子[9]。已知的DPP4蛋白酶家族主要包括成纖維細胞激活蛋白α、重組成纖維細胞激活蛋白α、DPP4、DPP8、DPP9、靜止細胞脯氨酸二肽酶、乙酰聚合γ-谷氨酸羧肽酶、葉酸水解酶、前列腺特異性膜抗原以及胸腺特異性絲氨酸蛋白酶等[10]。

最初的研究發現，DPP4屬于S9B蛋白質家族的絲氨酸外肽酶，由766個氨基酸組成，它可以裂解多肽N端的二肽，前提是殘基末端倒數第二氨基酸是脯氨酸、羥基脯氨酸、脫氫脯氨酸或丙氨酸；DPP4廣泛表達于細胞表面，發揮復雜的生物學作用，涉及細胞膜相關的細胞內信號轉導激活、細胞-細胞間的相互作用以及通過DPP4的膜錨定和可溶性形式顯示酶活性[9]。除了酶活性，DPP4的另一個重要功能是與一系列配體相互作用。有研究數據揭示了DPP4在細胞內信號轉導、細胞凋亡、氧化應激產生、免疫激活以及胰島素抵抗中發揮作用[11]。Wu等[12]證明，DPP9可被成纖維細胞活化蛋白通過非酶方式下調，促進人口腔鱗癌上皮-間充質轉化。此外，有報道顯示，DPP8和DPP9信使RNA在卵巢癌中表達較多，而DPP9在蛋白水平上表達較多[13]。這些活動賦予了DPP家族廣泛的分子功能，對癌癥和代謝性疾病的潛在病理作用具有臨床意義。近年的前臨床研究結果強調了DPP家族成員DPP4在血管內皮細胞生成中的作用[14]。

1.2DPP4的分布和生物學特性 DPP4是最有效的絲氨酸肽酶之一，在哺乳動物組織中廣泛表達；DPP4表達于內皮細胞、內皮祖細胞以及一些重要的免疫細胞(如自然殺傷細胞、單核細胞、淋巴細胞、樹突狀細胞)和病理狀態下的炎癥細胞[9]。由于DPP4的廣泛分布，使DPP4抑制劑成為一種在炎癥調節[15]、造血恢復、免疫調節和內皮細胞生成[14]等方面很有前景的治療藥物。膜結合的DPP4通過與質膜上或細胞外基質中的相鄰蛋白結合而具有催化活性和非催化活性。Chung等[16]的研究顯示，跨膜區域負責主要的酶活性。除了跨膜結構域，以可溶性形式溶解在血漿中的從細胞膜上切割下來的肽的胞外結構域也顯示酶活性[9]。

1.3DPP4與底物 DPP4通過調節豐富的底物發揮多種生理和藥理作用，目前已經證實，抑制DPP4可以通過胰高血糖素樣肽-1(glucagon-like peptide-1，GLP-1)途徑促進胰島素分泌，改善人體葡萄糖耐量[17]。也有研究表明，DPP4抑制劑可以改善無GLP-1受體小鼠的葡萄糖耐受性，提示DPP4具有獨立于GLP-1的生物學作用[18]。此外，DPP4在體外截斷了大量的肽激素和趨化因子，相對較少的肽已被鑒定為體內DPP4的內源性生理底物；已知許多細胞因子、趨化因子、激素和生長因子中存在公認的N端為丙氨酸或脯氨酸的DPP4截斷位點，包括基質細胞衍生因子(stromal cell-derived factor，SDF)-1α、集落刺激因子、粒細胞巨噬細胞集落刺激因子、粒細胞集落刺激因子、促紅細胞生成素、白細胞介素-3、白細胞介素-1α、白細胞介素-6、高遷移率族蛋白B1(high-mobility group box 1 protein，HMGB1)、促血小板生成素以及白血病抑制因子等[9]。這些證據表明，DPP4通過降解和修飾這些血管內皮細胞生成相關因子調控新生血管內皮細胞生成的可能性很高。

2 DPP4在分子水平對內皮細胞及血管生成影響的機制

內皮細胞作為血管內環境的主要調節因子，除了通過維持血管的完整性使血管屏障功能保持完整外，還是許多生理過程的重要組成部分，如調節血管舒張和收縮、平衡出血和凝血以及協調炎癥反應等[19]。當這些平衡系統被打破，發生內皮功能障礙時，內皮細胞轉化為激活表型，從而進一步增強單核細胞和血小板的黏附以及促炎和促血栓形成因子的合成，加劇氧化應激，最終導致血管受損[4]。研究表明，DPP4抑制劑能夠改善2型糖尿病患者和小鼠的內皮功能障礙[20]。DPP的個別家族成員可能參與了血管內皮細胞生成、血管疾病和癌癥的發生。

2.1DPP4通過氧化應激影響內皮細胞與血管生成 DPP4涉及機體炎癥反應，糖尿病患者胰島素抵抗本身或高糖狀態可促進DPP4的表達和釋放。用DPP4抑制劑治療載脂蛋白E基因剔除小鼠，不僅抑制了促炎因子白細胞介素-6和腫瘤壞死因子-α的表達，也降低了循環炎癥因子(如C反應蛋白、膜輔蛋白1、細胞間黏附分子-1)的循環水平[21]。而且抑制或沉默DPP4可降低衰老血管系統和衰老內皮細胞的內皮氧化應激水平，DPP4抑制劑可使AMP活化蛋白激酶α磷酸化和去乙酰化酶1表達[8]。氧化應激與炎癥和糖尿病緊密相關，長期高血糖不僅會促進活性氧類的產生，還會削弱抗氧化系統，整體上導致氧化應激顯著增加，一方面，氧化應激誘導脂蛋白和磷脂的氧化修飾；另一方面，氧化的四氫生物蝶呤可能導致內皮型一氧化氮合酶(endothelial nitric oxide synthase，eNOS)解偶聯，從而進一步增強氧化應激，減少一氧化氮(nitric oxide，NO)的產生；在內皮細胞線性模型中，DPP4增加了晚期糖基化終末產物誘導的活性氧類生成，增強了氧化應激[22]。因此，氧化應激在DPP4導致的內皮細胞損傷過程中發揮著重要作用，可能成為治療血管創傷的潛在靶點。

2.2DPP4通過GLP-1影響內皮祖細胞與血管生成 在病理條件下，內皮祖細胞對修復內皮細胞起著重要作用，內皮祖細胞是內皮細胞的前體，可分化為能分泌各種調節介質的成熟內皮細胞[23]。骨髓源的內皮祖細胞向缺血結構歸巢以增加新血管形成，在內皮損傷和缺血部位局部注射內皮祖細胞可加速大鼠血管和組織的修復[24]。糖尿病患者內皮祖細胞的數量顯著低于健康人，而血管并發癥患者的內皮功能與內皮祖細胞數量密切相關[25]。研究表明，DPP4可通過水解GLP-1導致內皮細胞功能障礙[26]。實驗數據表明，使用GLP-1激動劑類的DPP4抑制劑治療后內皮祖細胞數量增多[27]。這些發現說明，DPP4可以通過水解GLP-1抑制內皮祖細胞的動員和歸巢。

脂聯素是一種來源于脂肪細胞的脂肪因子，已被證明可以促進內皮細胞活化[28]。體內使用DPP4抑制劑可導致血漿脂聯素水平顯著升高[29]。Ishii等[7]證實，在缺血誘導的血運重建模型中，DPP4抑制劑顯著增加了GLP-1和脂聯素的表達，刺激內皮細胞網絡形成；而在脂聯素缺乏的小鼠中，DPP4抑制劑僅部分增加了缺血肢體肌肉的血流；GLP-1對血運重建的有益作用部分原因可能是升高了脂聯素水平，表明DPP4的血管損傷能力可能部分依賴于GLP-1/脂聯素機制。

2.3DPP4通過血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)-A/eNOS信號通路抑制血管內皮細胞與血管生成 近年的研究表明，GLP-1類似物利拉格魯肽在胰島移植中通過誘導VEGF表現出促進血管生成的特性[30]。由此推測，DPP4可能通過介導GLP-1/VEGF通路在血管生成過程中發揮作用。另有報道顯示，缺氧誘導因子-1α(hypoxia-inducible factor-1α，HIF-1α)的表達可以通過激活VEGF和誘導eNOS影響內皮祖細胞，從而促進內皮細胞募集[31]。Marfella等[32]的試驗和病理研究表明，在患有糖尿病足的患者中使用DPP4抑制劑維達列汀抑制DPP4，可使GLP-1水平升高，然后通過GLP-1調節的HIF-1α/VEGF通路減少氧化應激，利于血管生成和潰瘍傷口愈合。Ishii等[7]在小鼠模型中發現，DPP4抑制劑維達列汀可以通過提高GLP-1水平促使內皮細胞網絡形成，增加對照組小鼠缺血后肢的血流和毛細血管密度；更重要的是，維達列汀可不通過GLP-1促使人臍靜脈內皮細胞分化為血管樣結構。

DPP4介導的血管受損對缺血性應激反應的潛在分子機制包括：①藥理DPP4催化活性通過肉瘤激酶依賴的eNOS/蛋白激酶B激活機制，促進缺血組織的血管受損；②DPP4在體內的血管損壞活性既與GLP-1的依賴性作用有關，也與GLP-1的非依賴性作用有關；③GLP-1對體內血管生成的有益作用部分通過維達列汀增加脂聯素分泌的能力介導[7]。基于此，推測DPP4通過VEGF/肉瘤激酶依賴的eNOS/蛋白激酶B信號通路激活，而這種通路可能通過或不通過GLP-1依賴的機制。但DPP4與HIF-1α、eNOS、VEGF具體的相互作用目前尚不清楚，可能在血管生成過程的多個方面發揮重要作用。

2.4DPP4通過SDF-1刺激內皮祖細胞動員與血管生成 SDF-1是分子量為8 000的多肽，廣泛表達于骨髓、心臟、腎臟、腦、脾、肝、胸腺和肌肉；且SDF-1是受損組織分泌的重要細胞因子之一，能吸引骨髓來源的內皮祖細胞，促進缺血心肌組織的血管生成；另外，SDF-1的受體——CXC趨化因子受體[chemokine(C-X-C motif) receptor，CXCR]4是一種7次跨膜G蛋白受體，在多種不同類型的細胞中廣泛表達，如造血細胞、內皮細胞和基質細胞[33]。SDF-1/CXCR4通路參與調節內皮祖細胞的募集， 構成了血管修復的一個重要機制。DPP4不僅能夠使缺乏氨基端的SDF-1失去趨化能力，而且還能干擾含氨基端SDF-1的趨化[34]。與野生型(DPP4+/+)小鼠相比，缺乏DPP4(DPP4-/-)小鼠循環中完整的SDF-1水平更高[6]，表明血漿中SDF-1水平受內源性DPP4活性的控制。Segers等[35]研究顯示，重組SDF-1攜帶的突變對DPP4和基質金屬蛋白酶的裂解具有抗性，可促進嚴重缺血后肢小鼠模型形成側支動脈，并促進其血流恢復。針對DPP4活性的基因和藥物干預在很大程度上增強了造血干細胞對SDF-1的趨化性，而抑制DPP4能夠增強內皮祖細胞對SDF-1/CXCR4通路的依賴，使其向缺血血管歸巢，從而促進血管生成[36]。因此，DPP4作為調節SDF-1活性的主要蛋白水解酶，可能通過依賴SDF-1的信號通路，成為干細胞治療中促進血管生成的靶點。

臨床觀察發現，新生血管受損可能至少部分歸因于炎癥引起的骨髓衰竭和內皮祖細胞動員減少，而周圍動脈疾病患者骨髓DPP4和基質金屬蛋白酶9水平降低，DPP4與SDF-1/CXCR4通路相互作用也發生了改變[37]。Sun等[38]利用DPP4-/-大鼠模型檢測DPP4在血管內皮細胞生成中的作用，結果得出相反的結論，即DPP4在維持血管功能和組織灌注方面起積極作用；在實驗條件下，與年齡匹配的DPP4+/+大鼠相比，DPP4-/-大鼠內皮功能較差，循環內皮祖細胞數較少，對粒細胞-腦脊液和血管生成反應較差；而且缺血性手術后DPP4-/-大鼠骨髓與循環中的SDF-1α無濃度梯度，血液中其他SDF-1降解酶(如DPP8和DPP9)的代償性增加。另一方面，Leu等[39]指出，雖然DPP4基因抑制可以恢復糖尿病缺血誘導因子的動員，但粒細胞集落刺激因子誘導的動員需要DPP4活性，而且DPP4在骨髓、外周血及靶組織不同的干細胞間室中的表達和活性不同。因此，通過對人類和DPP4基因動物干細胞的分析，可以發現由組織特異性DPP4失調所導致的糖尿病骨髓衰竭的機制。

2.5DPP4通過NO影響內皮細胞與血管生成 NO是機體中重要的內皮細胞源性舒張因子，是在L-精氨酸轉化為L-瓜氨酸的過程中以eNOS為催化劑合成的[40]。作為一個內皮細胞源性調節因子，NO在維持血管張力調節中起關鍵作用[19]，能夠調節內皮細胞的增殖和凋亡，抑制血小板黏附和聚集，防止白細胞黏附和浸潤[41]。因此，NO產生減少是內皮功能障礙的可靠指標[19]。DPP4抑制劑(如維達列汀、西他列汀)可能通過刺激eNOS激活和增加NO的產生對糖尿病大鼠/小鼠內皮功能發揮保護作用[42]。值得注意的是，內皮素-1是血管內皮細胞分泌的一種強效血管收縮劑，具有促炎和促有絲分裂作用，西他列汀在糖尿病大鼠的主動脈內皮抑制內皮素-1表達，可能通過激活AMP活化蛋白激酶和抑制核因子κB信號通路改善內皮功能[43]。

在病理條件下，內皮細胞表面黏附分子(如細胞間黏附分子、選擇蛋白及血管黏附分子)和趨化因子(如單核細胞趨化蛋白1)表達增加，促進單核細胞與內皮細胞的黏附，刺激單核細胞向血管內皮細胞的跨內皮遷移并變為巨噬細胞[44]。研究發現，DPP4抑制劑可抑制血管黏附分子1、E-選擇素、細胞間黏附分子1在內皮細胞的表達[22]，說明DPP4通過抑制AMP活化蛋白激酶依賴的核因子κB途徑發揮強大的血管保護效應。

2.6DPP4通過HMGB1影響內皮細胞與血管生成 HMGB1是DPP4底物之一，具有DPP4裂解位點。HMGB1是一種高度保守的細胞因子，廣泛分布于哺乳動物細胞內。在傷口愈合的新血管形成過程中，HMGB1在促進內皮祖細胞歸巢和遷移中扮演重要角色。有研究表明，HMGB1通過促進胞外信號調節激酶1/2磷酸化，促進人臍靜脈內皮細胞生長，提高血管生成活性，而利用DPP4預處理后胞外信號調節激酶1/2磷酸化顯著降低，說明DPP4通過HMGB1-胞外信號調節激酶1/2信號通路影響內皮細胞，損害血管生成[45]。目前，DPP4損傷HMGB1血管生成功能的證據有限，但兩者間的關系已經建立，有必要進一步的臨床和基礎研究。

2.7DPP4與神經肽Y(neuropeptide Y，NPY)在血管生成中的作用 NPY是一種由下丘腦分泌的由36個氨基酸構成的多肽。據報道，NPY可以促進內皮細胞的增殖和遷移[46]。研究表明，NPY與DPP4共培養，DPP4將Tyr(1)-Pro(2)從NPY(1-36)上裂解下來，形成了具有促進血管生成作用的NPY(3-36)，而NPY(3-36)是一種非Y1受體激動劑(Y1受體是NPY受體的一種亞型)；而動脈粥樣硬化組織微血管內皮中DPP4的表達可能改變NPY，使NPY對血管生成受體(Y2受體和Y5受體)具有親和力，從而增強血管生成作用[47]，這種變化是動脈粥樣硬化的病理表現。一項癌癥生物學研究表明，缺氧可改變NPY活性，使依賴Y1受體和Y5受體的NPY細胞凋亡，激活Y2受體/Y5受體/DPP4/NPY(3-36)信號通路，可增強尤氏肉瘤干細胞的活性，促進血管生成[48]。因此，DPP4可能通過改變NPY活性促進血管生成。

NPY對血管生成反應非常重要，但也有學者提出相反的意見。例如，一項體外研究顯示，盡管內皮細胞損傷刺激了DPP4的表達，但用單克隆抗體(E19和E26)阻斷DPP4，可顯著阻礙人類臍靜脈內皮細胞遷移，NPY(1-36)可阻斷創面愈合，而NPY(3-36)則具有血管生成作用，內皮功能障礙導致NPY升高，NPY通過增加炎癥細胞的趨化性引發血管炎癥[46]。這些發現表明，DPP4在血管生成過程中起相反的作用。DPP4與NPY相互作用、調控血管生成的具體機制仍需從血管生成相關的生理學和病理學角度進一步明確。

3 小 結

DPP4作為水解酶水解腸促胰島素及其他底物，可與多種細胞因子結合，調節多種信號通路，導致內皮功能障礙，參與血管生成過程。DPP4 抑制劑除降糖作用外，在炎癥性疾病以及糖尿病心血管并發癥有中也有重要作用。因此，建立藥物DPP4催化活性抑制相關的陰性和陽性血管生成作用下的分子生物學基礎非常重要。未來關于DPP4機制的研究需要關注催化和非催化功能在2型糖尿病血管并發癥中的相對作用，而臨床試驗將著重處理DPP4水平升高與2型糖尿病心血管并發癥的相關性，并深入研究DPP4抑制劑在2型糖尿病心血管并發癥中的有益作用。