痛風炎癥發作與消散調控機制研究進展

陳丁鵬，李華南，甘斌，章曉云，陳玉年，顧兵

(1.江西中醫藥大學臨床醫學院，南昌 330004； 2.江西中醫藥大學附屬醫院骨傷三科，南昌 330006；3.江西科技師范大學生命科學院，南昌 330013)

痛風系嘌呤代謝紊亂和(或)尿酸排出減少，血尿酸增高，導致單鈉尿酸鹽(monosodium urate，MSU)結晶沉積在關節或軟組織而引發的自限性炎癥性疾病，臨床常表現為四肢關節反復紅、腫、熱、痛和嚴重關節畸形，甚至伴有痛風性腎病等并發癥[1]。根據痛風病理變化，其可分為高尿酸血癥期、急性期、間歇期及慢性期。經高尿酸血癥期(無癥狀)——急性期(急性痛風性關節炎)——間歇期(無癥狀)的數次病程反復，體內大量痛風石形成，標志著病程進入痛風慢性期[2]。1990—2017年，全球痛風標準患病率約為7.9‰[3]，我國痛風患病率約為1.1%[4]，痛風患病率存在性別和地區差異，且呈逐年升高且年輕化趨勢[5]。目前，臨床多采用降尿酸、抗炎鎮痛、使用免疫抑制劑等治療，停藥后易復發，臨床治療難度較大，嚴重影響患者生活，因此需進一步研究痛風的深層次病理機制。現對痛風炎癥發作與自行消散調控機制予以綜述，以期為后續痛風治療研究提供參考。

1 痛風炎癥急性發作

痛風急性發作可見局部紅、腫、熱、痛等特征表現，為痛風性關節炎最普遍的癥狀，MSU結晶介導炎癥是痛風急性發作的病理基礎[6]。當尿酸濃度高于溶解度時，MSU結晶形成并沉積在關節周圍，被中性粒細胞、巨噬細胞及炎癥因子[NOD樣受體蛋白[7]、嘌呤受體2(purinoceptor 2,P2)[8]]等識別，激活相關信號通路并釋放炎癥介質，致使白細胞介素(interleukin，IL)-1β在局部募集而引發急性炎癥。

1.1IL-1β與痛風急性發作 IL-1由IL-1α和IL-1β組成，其中IL-1β是IL-1家族核心成員。幾乎所有核細胞均可分泌IL-1β，并作用于鄰近細胞或遠處靶細胞介導炎癥反應。由于MSU結晶誘發痛風，網狀DNA雙鏈解開，細胞膜破壞，大量釋放的IL-1β、腫瘤壞死因子及IL-6被免疫系統識別并發出警報。隨著細胞損傷程度逐漸加重，大量ATP和尿酸釋放到關節腔中，誘導中性粒細胞氧化應激產生ATP，加重損傷[9]。Leffler等[10]證實，針狀MSU、IL-1β甚至急性痛風患者的血清、滑液均可刺激正常人中性粒細胞產生中性粒細胞胞外誘捕網(neutrophil extracellular trapping nets，NETs)，而IL-1抑制劑未能刺激中性粒細胞產生NETs。同時，活化的IL-1β可上調活性氧類(reactive oxygen species，ROS)水平，誘導中性粒細胞釋放大量NETs、炎癥介質、中性粒細胞引誘劑、CXC趨化因子配體(CXC chemokine ligand，CXCL)8和中性粒細胞激活劑(CC趨化因子配體3、CXCL10等)至血液中，IL-1引起血管擴張，刺激CXCL8、CXCL1、CXCL2、CXCL3和其他免疫因子迅速聚集[11]。血液中的中性粒細胞被選擇素吸附至內皮細胞表面，通過體液循環進入關節間隙后，大量中性粒細胞累積致劇烈炎癥反應發生。由此可見，IL-1β是引發痛風炎癥的重要因素[12-13]，且MSU結晶直接刺激或中性粒細胞受損后氧化產生的IL-1β均可導致機體產生嚴重反應。目前，大多學者致力于尋找抑制IL-1β產生的生物制劑[如康納單抗和阿那白滯素]，此類藥物可使患者臨床獲益，但停藥后病情易反復。因此，僅抑制IL-1β產生無法取得良好效果，可能阻斷IL-1β產生、減少細胞損傷才是解決炎癥的關鍵。

1.2核苷酸結合寡聚化結構域樣受體蛋白(nucleotide-binding oligomerization domain-like receptor protein，NLRP)3炎癥小體介導的痛風急性發作 固有免疫細胞可直接參與痛風的急性發作，啟動該過程的關鍵物質是NLRP[14]，目前NLRP研究主要集中在NLRP3炎癥小體。NLRP3炎癥小體表達于固有免疫細胞胞質內[15]，是主要由NLRP3受體蛋白、胱天蛋白酶(caspase)-1和凋亡相關斑點樣蛋白(apoptosis-associated speck-like protein containing a CARD，ASC)共同構成的蛋白復合體[16]。ASC作為一種連接蛋白，其C端重復的亮氨酸序列可識別多種內源性危險信號，如尼格霉素、ATP、MSU結晶等[17-18]。caspase-1是NLRP3內具備促炎作用的效應蛋白，影響宿主對感染的固有免疫調節[19-20]。孤立MSU結晶不會引發痛風，需要由NLRP3炎癥小體誘導產生促炎因子活化NLRP3并激活效應caspase-1，使原本無生物活性的IL-1β前體轉化成活性IL-1β[21]，并排出細胞外，參與痛風炎癥反應。此外，ROS在NLRP3激活中的作用不可或缺。MSU晶體通過激活線粒體外膜透化作用損傷線粒體DNA并抑制其自噬，產生的過量ROS將活化NLRP3炎癥小體，從而誘導炎癥擴增[22]。研究發現，抑制巨噬細胞中NLRP3炎癥小體產生可使炎癥得到改善[23-24]。可見，NLRP3炎癥信號通路可通過ASC識別MSU晶體并啟動固有免疫應答，產生活性IL-1β并觸發炎癥反應。許多學者正在進行NLRP3的相關研究，但目前仍沒有批準上市的NLRP3拮抗劑。因此，針對NLRP3發揮效應時需募集ASC和caspase-1的特性而研發的選擇性拮抗劑，可能對迅速控制炎癥有幫助。

1.3P2X7受體介導的痛風急性發作 P2受體是炎癥的主要介質，包括P2X受體(離子通道)和P2Y受體(代謝)兩大類。P2X7受體由第12號染色體基因編碼595個氨基酸構成，易形成三聚體，并以寡聚體的形式散布在胞膜表層[25]，屬于生理性ATP離子通道型受體，參與各種炎癥因子的加工和表達，如IL-18、IL-1β、腫瘤壞死因子-α等[26]。單核細胞跨膜受體——P2X7受體通過滲透溶解刺激細胞死亡并調節IL-1β等炎癥介質釋放[27]。在病理條件下，P2X7受體與胞外ATP結合使陽離子通道開放(如K+外流以及Na+、Ca2+內流)[28]，參與調節K+外流，使細胞內K+濃度降低，活化NLRP3炎癥小體并啟動caspase-1，間接促進IL-1β等炎癥因子的成熟、分泌[29]。de Torre-Minguela等[30]發現，M1極化巨噬細胞表面P2X7受體激活后，誘導NLRP3重組，釋放促炎因子并建立免疫應答。在敲除P2X7基因以及經P2X7受體抑制劑處理小鼠中發現，ATP誘導產生IL-1α、IL-1β和IL-18的功能被抑制，小鼠炎性疼痛反應減弱[31-32]。多項研究提示，抑制P2X7受體能阻斷P2X7，達到緩解炎癥反應的目的，某些藥物雖然可以與P2X7受體結合，但副作用不能忽視。故將P2X7作為靶向藥物治療痛風時，還需提高拮抗劑治療效果以及降低副作用等。

2 痛風炎癥消散相關機制

痛風炎癥反應通常兩周左右自行消散，而中性粒細胞和巨噬細胞的免疫防御及炎癥調節等功能是炎癥疾病自限的重要原因，此過程涉及多細胞因子、多機制的協同參與。在炎癥過程中，單核細胞衍生的巨噬細胞可調控機體反饋機制，上調Toll樣受體(Toll-like receptor，TLR)及抗炎因子[如轉化生長因子(transforming growth factor，TGF)]的產生，發揮促炎癥介質分解和抗炎功能[33]。當機體炎癥因子清除障礙時，炎癥易呈現慢性化表現[34]。另外，中性粒細胞可產生網狀結構的NETs，繼而包裹MSU結晶形成痛風石，以降低關節周圍MSU結晶的水平，使炎癥局限。通過阻斷炎癥信號通路、減少趨化因子和促炎因子的分泌，可有效限制炎癥的發展。

2.1TLR信號通路在痛風緩解中的作用機制 TLR是調節固有免疫的特殊跨膜蛋白，可識別各種原因引起的損傷，誘發機體的免疫應答反應。TLR有兩種信號通路：依賴型髓樣分化因子88(myeioid differentiation factor 88，MyD88)信號通路和非依賴型MyD88信號通路。MyD88是介導依賴型TLR信號通路的重要銜接蛋白，由近130個氨基酸C端Toll/IL-1受體結構域與近90個氨基酸N端死亡結構域組成。C端與蛋白連接后傳遞信息，N端辨別其他相似結構蛋白(如IL-1受體相關激酶)。TLR指主要存在于中性粒細胞和巨噬細胞等表面的膜蛋白，可特異性識別外來病原體[35]，其活化可引發中性粒細胞和巨噬細胞分泌大量促炎介質[36]，如TLR2、TLR4。TLR通過調節核因子κB(nuclear factor-κB，NF-κB)產生多種細胞因子，引發炎癥級聯反應[37]。TLR2/TLR4還能介導MyD88依賴型通路，MyD88可以促進IL-1受體相關激酶1和IL-1受體相關激酶4的相互作用，激活NF-κB激酶抑制蛋白。NF-κB抑制蛋白α可被釋放活化后的NF-κB激酶抑制蛋白磷酸化并向細胞核釋放NF-κB，加速轉錄與表達促炎基因，促進IL-1β、腫瘤壞死因子-α和IL-6等炎癥因子分泌，產生炎癥反應[38-39]。MyD88缺乏可抑制下游IL-1受體相關激酶激活，負反饋調節TLR4的水平，以減弱炎癥。而在非依賴型MyD88信號通路中，TLR相關分子與TLR4結合并活化TLR相關干擾素活化子，使NF-κB產生干擾素并釋放IL-1β、腫瘤壞死因子-α和一氧化氮等炎癥因子，引發炎癥反應。由于MyD88介導的TLR信號通路激活有雙向調節作用，因此在調節該通路時，如何調控MyD88以達到控制炎癥并阻斷非依賴型信號通路形成可能成為未來研究的重點。

2.2TGF-β1在痛風緩解中的作用機制 TGF-β家族成員均由半胱氨酸和二聚體構成，具有多個亞族，包含TGF-β、抑制素、激活素等。在哺乳動物中，以TGF-β1、TGF-β2及TGF-β3常見[40]。原始TGF-β前體是無活性物質，需經細胞因子刺激后與特定TGF-β受體(TGF-β receptor，TβR)結合才能激活并發揮作用[41-42]。TβR是一類跨膜蛋白(如TβR- Ⅰ、TβR- Ⅱ、TβR-Ⅲ)，與細胞膜具有高親和力，TβR-Ⅰ和TβR-Ⅱ與TGF-β1的結合力強于TβR-Ⅲ[43]。當MSU晶體刺激中性粒細胞時，部分中性粒細胞通過外捕作用觸發非炎癥細胞清除和抗炎TGF-β1產生。TGF-β1首先與TβR- Ⅱ 結合并將TβR- Ⅰ 磷酸化[44]，進而激活Smad蛋白(主要為Smad2/3)，形成介導TGF-β1信號的膜受體蛋白。在輔助受體、轉錄因子以及激活因子共同作用下，通過下調IL-1受體基因的轉錄與表達減少IL-1R產生，從而降低細胞內IL-1β水平；此外，巨噬細胞可攝取MSU晶體產生TGF-β1，阻斷NLRP3炎癥小體對IL-1β前體的加工，限制IL-1β分泌而緩解炎癥。因此，TGF-β1/Smad作為體內重要免疫調節信號通路，可從根源上控制炎癥進展(通過阻斷炎癥因子基因的表達與轉錄達到炎癥消散的目的)。

2.3NETs在痛風緩解中的作用機制

2.3.1NETs的組成 NETs由中性粒細胞解聚的DNA染色質纖維與組蛋白構成[45]。NETs中包含由核小體組成的細胞外纖維網狀結構——髓過氧化NETs，其表面布滿中性粒細胞組織蛋白酶和DNA組蛋白復合物等組分。Brinkmann等[45]在痛風小鼠染色組織中發現了NETs的完整結構，經DNA酶處理后，其整體結構被破壞；反之，經蛋白水解酶處理后，DNA結構完整性仍存在，證實DNA是NTEs的主要結構。Sollberger等[46]發現，除具備殺滅病原體作用外，氫酶、組織蛋白酶、中性粒細胞彈性蛋白酶、組蛋白等活性蛋白還可參與組織損傷等多種疾病的進展。組蛋白通過刺激中性粒細胞形成NETs并參與組織損傷，且較MSU結晶引起的病程更短[47]。精氨酸脫亞氨酶4是NETs形成的核心物質，可使組蛋白瓜氨酸化[48]。髓過氧化氫酶可將過氧化氫轉化為次氯酸，該物質被認為是中性粒細胞產生的最強抗菌氧化物[49]。由此可見，DNA是NETs的核心成分，而顆粒蛋白是其中起主要作用的一種抗菌物質，且NETs功能的發揮依賴完整的結構。

2.3.2NETs的形成機制 中性粒細胞最初由骨髓母細胞向早幼粒細胞發展，進而分化為骨髓細胞、骨髓后細胞和分段的中性粒細胞[50]，最終完整成形。12-豆蔻酸-13-乙酸佛波醇、病原微生物(如細菌、病毒)、脂多糖、IL-8、損傷相關分子等[51]均可刺激中性粒細胞產生NETs，這種形成NETs的途徑稱為NETosis。NETosis主要有以下3種形成機制：①線粒體DNA釋放性NETosis。線粒體DNA可被中性粒細胞和其他免疫細胞識別，并與細胞因子及天然抗體協同調節炎癥反應[52-53]。在脂多糖或補體5受體作用下，80%的中性粒細胞可在15 min內形成NETs[54]。②自殺式NETosis。此過程依賴ROS及促分裂原活化的蛋白激酶通路。12-豆蔻酸-13-乙酸佛波醇激活中性粒細胞產生還原型輔酶氧化物，從而促使ROS產生[55]；同時，肽酰基精氨酸脫亞氨酶4在鈣離子影響下具有催化活性，使中性粒細胞瓜氨酸化，形成NETosis，表明肽酰基精氨酸脫亞氨酶4和ROS是誘導組蛋白瓜氨酸生成和自殺的重要因素，也是自殺式NETosis的核心機制[56-57]。③細胞核DNA釋放性NETosis。此過程不依賴ROS及促分裂原活化的蛋白激酶通路。由金黃色葡萄球菌或TLR4活化血小板等識別細胞表面TLR或C3補體，隨后細胞核DNA以囊泡形式釋放。不同胞質附著在囊泡周圍形成NETs排出細胞外，但核膜仍完整，中性粒細胞尚保留吞噬和趨化等作用。上述3種形成NETs的方式均通過增加自身抗原與傳染性抗原之間締合的可能性損害病原體的清除能力，并可能觸發自身免疫反應，使炎癥無法有效控制。可見，NETs具有雙向調節性，既可借助組蛋白殺滅病原體，又可通過NETosis的方式損傷機體。因此，通過選擇性阻斷NETosis過程減少自身免疫反應，或許可改善痛風炎癥。

2.3.3NETs與痛風石的形成 痛風石指無法及時清除的MSU晶體與免疫細胞、炎癥細胞和纖維囊等形成的肉芽腫樣結構[58]，是慢性痛風的典型特征。在痛風急性發作后期，MSU晶體沉積位點募集大量中性粒細胞，同時促炎介質(如IL-1β和腫瘤壞死因子-α)持續刺激中性粒細胞形成NETs，高濃度NETs逐漸聚合并形成聚集性NETs(aggregated neutrophil extracelluar trapping nets，aggNETs)。Schauer等[59]發現，aggNETs能快速捕獲趨化因子和促炎因子，通過降低促炎因子水平以及抑制中性粒細胞堆積控制炎癥進展；另外，MSU晶體可被aggNETs包裹，阻止炎癥介質形成痛風石，以緩解痛風，從而減少機體急性損傷[60]，但該機制是建立在脫氧核糖核切酶1和脫氧核糖核切酶1樣酶3及時分解NETs的基礎上[59-61]；Hahn等[62]在刺激誘導aggNETs生成模型中發現，aggNETs具有降解炎癥介質的能力，由于中性粒細胞募集、激活并形成aggNETs，導致MSU晶體反復沉積以及NETs累積，該過程有利于痛風石形成，有助于炎癥消退。可見，長期無急性炎癥反應的痛風石可能與NETs有關，且aggNETs在該過程中的作用不可或缺，故在慢性痛風期時，可通過誘導提高aggNETs水平，緩解痛風炎癥。

3 小 結

隨著人民生活水平的提高以及飲食結構的改變，近年國內外痛風患病率均呈上升趨勢，給國家和社會帶來沉重負擔。目前臨床痛風的治療措施尚不完善。因此，研究者試圖通過研究痛風炎癥急性發作和消散所涉及分子機制及其相互之間作用的研究尋找痛風的治療措施，但目前多為單一通路的研究(如P2X7、NLRP3)，而多通路間相關作用的研究較少。此外，痛風炎癥消散機制研究熱點集中在TLR抑制IL-1β產生、巨噬細胞分泌抗炎TGF-β1、NETs借助網狀結構包裹MSU晶體等方面，而TGF-β1的研究尚處于初級階段。未來，相關研究更傾向于TGF-β1所涉及的信號通路、明確關鍵蛋白分子、確定特異性結合點等方面，故TGF-β1有望成為治療痛風的特效性靶點。