ω-3多不飽和脂肪酸與卵母細胞質量相關性研究進展

郭子瑜，錢云

(南京醫科大學第二附屬醫院生殖醫學中心，南京 210011)

隨著人類輔助生殖技術的不斷發展，與卵母細胞質量相關因素的研究越來越受到關注。雖然體外培養條件可能對早期胚胎的發育潛能具有一定影響，但卵母細胞質量是決定卵母細胞能否發育至囊胚的關鍵因素[1]。作為卵母細胞直接和必要的微環境，卵泡液通過各種代謝產物的累積為卵母細胞提供營養物質和生長因子，促進其生長發育[2]，因此卵泡液的組分變化對卵母細胞質量至關重要。在卵泡液的脂質組成成分中，飽和脂肪酸和單不飽和脂肪酸被認為是一次性能源，而多不飽和脂肪酸(polyunsaturated fatty acids，PUFAs)則具有持續而廣泛的作用[3]。PUFAs主要包括ω-3PUFAs和ω-6PUFAs，其中ω-6PUFAs與女性生殖系統疾病關系的研究已較為成熟，而ω-3PUFAs與女性生殖領域關系的研究相對較少。ω-3PUFAs在促進人體健康、降低疾病風險方面均具有重要作用，如改善乳腺癌[4]、心腦血管疾病[5]及糖尿病[6]的發生發展等。近年來，ω-3PUFAs在女性生殖系統疾病中的研究也逐漸深入。ω-3PUFAs廣泛存在于卵泡液及卵母細胞中，是卵泡形成過程中細胞增殖所必需的能量儲備分子，可調節卵泡的生長及成熟，ω-3PUFAs組成、濃度和相對豐度的改變與卵母細胞質量密切相關，影響女性生育能力[7-8]。但目前關于ω-3PUFAs改善卵母細胞質量的研究結果并不一致，還需要進一步深入研究加以驗證。現就ω-3PUFAs與卵母細胞質量相關性的研究進展予以綜述。

1 ω-3PUFAs概述

ω-3PUFAs是維持人體正常生長發育所必需的脂肪酸，主要通過飲食或營養補充獲得。ω-3PUFAs主要包括α-亞麻酸(α-linolenic acid，ALA)、二十碳五烯酸(eicosapentaenoic acid，EPA)和二十二碳六烯酸(docosahexaenoic acid，DHA)。ALA廣泛存在于植物油、海洋藻類和天然草本植物中，如亞麻籽、核桃和大豆油；EPA和DHA主要存在于魚油中，如鮭魚、沙丁魚和鯡魚油。ALA是合成一系列長鏈ω-3PUFAs的前體，在肝臟中通過去飽和以及延長反應轉化為EPA和DHA；日常飲食中富含的亞油酸可與ALA競爭性抑制合成長鏈ω-3PUFAs的關鍵酶Δ6-脂肪酸去飽和酶，因此，在人體中只有約8%的ALA轉化為EPA，不足4%的ALA轉化為DHA[9]。

ω-3PUFAs以乙酯、三酰甘油和磷脂為主要存在形式，因此其生物利用度也不同。與乙酯形式的ω-3PUFAs相比，三酰甘油形式的ω-3PUFAs具有更好的生物利用度，而磷脂形式ω-3PUFAs的生物利用度目前尚不明確[10]。研究發現，納米乳液系統可提高長鏈ω-3PUFAs的生物利用度，但目前納米乳液的制備和加工方法均可能影響ω-3PUFAs的氧化穩定性[11]，因此改良ω-3PUFAs納米乳液可能是未來ω-3PUFAs相關制劑的研究方向。

2 ω-3PUFAs對卵母細胞的影響及相關機制

2.1ω-3PUFAs調節卵母細胞質量相關脂質代謝 脂質代謝是卵母細胞成熟過程中的重要能量來源，卵母細胞及其周圍卵丘顆粒細胞內的脂質代謝與卵母細胞質量及胚胎發育密切相關。在卵泡微環境中，影響卵母細胞質量的相關脂質代謝主要包括類固醇激素的生成和脂質含量的改變。卵巢類固醇激素的生成可調節卵泡發育、卵母細胞的減數分裂成熟以及胚胎質量。研究表明，體液循環中的ω-3PUFAs可通過調節類固醇激素代謝過程中的關鍵酶影響卵母細胞、胚胎和胎兒的發育[12]。Wang等[13]給成年大鼠膳食中添加DHA補充劑，48 h后(血漿DHA半衰期約為1.63 d)，與基礎飲食組大鼠相比，DHA飲食組大鼠血清三酰甘油水平降低；進一步通過非靶向代謝組學分析大鼠血清樣本發現，DHA的代謝效應與花生四烯酸、類固醇激素和多胺代謝相關，推測DHA通過自身代謝及協同其他脂類物質調節脂質代謝而發揮一系列有益作用。此外，在雌兔胚胎著床前(人工授精5～7 d)和著床后(人工授精7～14 d)補充DHA和EPA，可提高血漿孕酮水平，有利于增加胚胎植入后的存活率并促進胎盤形成[14]。哺乳動物卵母細胞中的脂質水平反映了脂肪酸β-氧化的程度，脂質水平過高可導致內質網應激、氧化應激和DNA損傷等，從而降低卵母細胞質量[15]。在豬卵母細胞體外成熟培養基中添加低水平DHA培養44 h后發現，卵母細胞及第7天囊胚中的脂質水平顯著降低，而卵裂率和囊胚細胞數目顯著增加，表明補充DHA可能通過降低卵母細胞及胚胎中的脂毒性，促進豬卵母細胞成熟并提高其發育潛能[16]。然而，Oseikria等[17]指出，高濃度DHA可導致顆粒細胞中脂質和類固醇激素代謝紊亂，從而降低卵母細胞的質量。Nikoloff等[18]研究發現，在培養基中添加高水平EPA后，卵母細胞內脂質水平降低且脂質滴形態改變，同時卵母細胞成熟率降低，但抗氧化劑可改善這一結局，雖然EPA可在一定程度上降低卵母細胞內的脂毒性，但卵丘卵母細胞內的氧化應激水平仍較高，減弱了其對卵母細胞的有利影響，甚至最終表現出一定的損害作用。由此認為，低劑量的ω-3PUFAs可通過調節脂質代謝提高卵母細胞質量、促進胚胎發育，同時對妊娠結局產生有益影響，但ω-3PUFAs濃度過高則可能會對卵母細胞產生不利影響。

目前關于ω-3PUFAs作為卵母細胞內脂質代謝調節劑的研究相對較少，且研究結論尚未統一，未來仍需更多設計嚴謹的實驗進一步確定不同類型、不同濃度的ω-3PUFAs對卵丘卵母細胞內脂質水平及脂質代謝相關基因表達水平的影響，并評估其對卵母細胞成熟及胚胎發育的作用。

2.2ω-3PUFAs影響卵母細胞內前列腺素(prostaglandin，PG)的生成 ω-3PUFAs不僅是體內各種生理過程的重要能源，還是PG合成的直接前體。PG是由細胞膜磷脂、磷脂酰乙醇胺以及磷脂酰肌醇釋放的PUFAs通過磷脂酶A2作用生物合成的一種脂類激素，參與調節卵丘-卵母細胞復合體的擴展以及卵母細胞的成熟，是哺乳動物排卵的中樞調節因子。PG主要包括5種類型，即PGE2、PGD2、PGF2α、PGI2和血栓素，其中PGI2、PGE2及PGF2α的生成與女性生育能力的關系研究較為廣泛。

ω-3PUFAs衍生的PGI2通過激活過氧化物酶體增殖物激活受體(peroxisome proliferator activated receptor，PPAR)參與胚胎的發育和著床[19]；PGE2則通過結合卵丘顆粒細胞上的G蛋白偶聯受體介導自分泌或旁分泌調節途徑，誘導促排卵相關基因表達并提高卵母細胞內環腺苷酸水平，在卵母細胞減數分裂成熟、卵丘顆粒細胞擴展以及卵泡破裂等排卵級聯過程中起重要作用[20]。研究表明，在體外培養液中添加ALA可增加卵丘-卵母細胞復合物中PGE2合成并提高環腺苷酸水平，促進卵母細胞核成熟，而添加PG環加氧酶2抑制劑NS-398則可顯著降低卵母細胞成熟率[21]。PGF2α是重要的外周循環炎癥標志物，通過干擾發情周期、分娩過程和胚胎存活而影響生殖結局。有研究報道，高水平ω-3PUFAs的攝入與PGF2α水平呈負相關，因此ω-3PUFAs可能發揮抗炎作用[22]。此外，ω-3PUFAs還可通過影響PG合成過程中的關鍵酶，間接影響PG的表達。環加氧酶2是體內合成PG過程中的限速酶，ω-3PUFAs可通過調節卵母細胞中環加氧酶2的活性和相關基因的表達，減少其下游2系列PG(如PGF2α)生成，促進炎癥生物效價低的3系列PG產生，最終降低卵母細胞內的炎癥反應[23]。另有研究表明，EPA和DHA能夠產生具有抗炎作用的保護蛋白和具有抑炎作用的溶解素，以抑制炎癥反應，成人每天攝入EPA與DHA的總量>2 g可能起到抗炎作用[24]，但目前關于ω-3PUFAs相關制劑的劑量學研究仍處于起步階段。綜上，ω-3PUFAs可通過直接或間接調節不同亞型PG的生成，增加促排卵相關基因的表達，減輕炎癥反應，對卵母細胞成熟及發育潛能產生積極影響。

2.3ω-3PUFAs改變卵母細胞膜的組成和功能 ω-3PUFAs是哺乳動物細胞膜磷脂雙層結構的重要組成部分，不僅可為膜蛋白(如受體、轉運蛋白、通道蛋白及黏附蛋白)提供最佳的支架，還可作為許多信號通路中各種親脂性配體的前體[25]。ω-3PUFAs的含量和類型不僅影響卵巢類固醇激素的合成，還可影響卵母細胞成熟、子宮功能及妊娠結局。有研究指出，飲食中ω-3PUFAs含量及類型的變化可導致卵母細胞膜中ω-3PUFAs含量及類型的相應改變[26]，影響卵母細胞膜流動性、細胞內信號的轉導和氧化損傷的易感性[7]，最終影響生殖結局。

在輔助生殖過程中，低溫冷凍保存技術廣泛應用于卵母細胞和胚胎的保存，伴隨該技術產生的不良后果主要包括低溫損傷和低溫保護劑的毒性作用。目前的實驗方法仍無法規避這些問題，未來需要開發新的策略來提高低溫保存的效果。在低溫冷凍等應激狀態下，卵母細胞膜的組成及完整性是保護其發育能力不受損害的基礎。研究發現，補充ω-3PUFAs可增加血漿和卵丘顆粒細胞中長鏈ω-3PUFAs含量，維持低溫處理后卵母細胞膜的完整性，提高基礎卵泡數和優質卵母細胞數，改善低溫冷凍后的卵母細胞質量[27]。在Δ6-脂肪酸去飽和酶缺陷小鼠模型中，自幼鼠培養開始，持續補充花生四烯酸和DHA至成年，可重塑PUFAs缺乏小鼠的卵巢和睪丸膜脂質體，促進卵巢周期中的正常縫隙連接網絡重組和支持細胞-血-睪丸屏障的重建，表明花生四烯酸和DHA是女性卵巢及男性睪丸膜磷脂體和鞘磷脂體中的關鍵結構[28]。此外，Moallem等[29]研究顯示，卵丘-卵母細胞復合物可選擇性地攝取不同類型的ω-3PUFAs，與短鏈ω-3PUFAs(如ALA)相比，長鏈ω-3PUFAs(如EPA和DHA)更易進入卵母細胞。卵母細胞的這種選擇性功能表明卵母細胞膜對脂肪酸組成變化高度敏感，可能導致與功能特性相關的膜流動性變化，說明卵母細胞膜上可能存在某些影響卵母細胞成熟及發育的保護性分子機制，但目前具體機制仍不明確，還有待進一步研究。

2.4ω-3PUFAs調節卵母細胞內氧化應激水平 在卵母細胞內，線粒體參與調節ATP生成、鈣穩態、氧化應激水平、細胞內多種信號轉導及細胞凋亡。卵母細胞內氧化應激水平的調節對卵母細胞核成熟至關重要，氧化應激的產生與抗氧化能力的不平衡可能導致DNA損傷和細胞凋亡。Marei等[30]在牛卵母細胞體外成熟培養基中添加低濃度ALA，結果顯示，在不影響卵母細胞內線粒體分布和含量的情況下，ALA可通過降低氧化應激水平促進細胞核成熟，最終提高卵母細胞成熟率。另有研究表明，在牛卵丘-卵母細胞復合體體外成熟培養基中添加高水平非脂化脂肪酸(棕櫚酸、硬脂酸和油酸)后，卵母細胞內氧化應激水平升高、囊胚率降低以及囊胚細胞凋亡標志物表達增加，即發生卵母細胞發育潛能損害；而聯合添加生理濃度的ALA后，卵丘顆粒細胞中線粒體膜電位在一定程度上恢復正常，導致細胞內氧化應激水平降低，有助于減少卵丘顆粒細胞凋亡且部分恢復卵丘顆粒細胞擴展能力，最終改善卵母細胞在脂毒性條件下的發育能力[31]。然而，Wakefield等[32]給予小鼠補充相對高水平的ω-3PUFAs，結果顯示，高水平ω-3PUFAs飲食組小鼠卵母細胞內的線粒體分布和鈣水平發生改變，氧化應激水平升高，導致卵母細胞受精后的囊胚率降低，胚胎畸形率顯著升高。

目前關于ω-3PUFAs影響卵母細胞內線粒體功能及氧化應激水平的研究結果不一致，主要原因可能為實驗中補充的ω-3PUFAs水平不一。適宜劑量的ω-3PUFAs可能有利于降低卵母細胞內氧化應激水平，改善卵母細胞質量，而過量ω-3PUFAs則可能損害卵母細胞的成熟及發育潛能。ω-3PUFAs補充劑量與卵母細胞內氧化應激水平的關系仍需更多研究證實，ω-3PUFAs對卵母細胞質量及女性生育能力改善均具有重要意義。

2.5ω-3PUFAs激活卵母細胞促分裂原活化的蛋白激酶(mitogen activated protein kinase，MAPK)信號通路 MAPK信號通路是一種高度保守的、重要的細胞內信號轉導通路，參與調節細胞的多種生理功能。MAPK通路激活在卵母細胞減數分裂恢復、卵丘顆粒細胞擴展以及排卵事件中均具有重要作用。MAPK可調控卵母細胞減數分裂過程中紡錘體的組裝、維持染色體的正常排列，并參與維持減數分裂中期阻滯等微管動力學的調節[33]。MAPK通路激活可導致其他蛋白激酶通路激活，并通過調節卵丘顆粒細胞與卵母細胞間縫隙連接的通透性影響減數分裂，抑制物質的運輸，同時通過調節相關基因轉錄活性影響甾體激素的產生、卵丘顆粒細胞外基質蛋白的合成以及各種成熟調節分子的活性[34]。研究顯示，DHA通過結合卵母細胞表面非脂化脂肪酸受體4激活MAPK相關信號通路，提高牛卵母細胞成熟率及受精后的囊胚率，而對卵丘-卵母細胞復合物中的脂質水平及脂質代謝相關的基因表達無顯著影響[26]。Marei等[21]研究發現，補充ALA可增加卵丘顆粒細胞中的環腺苷酸水平，引起卵丘-卵母細胞復合物中MAPK1和MAPK3磷酸化，提高卵母細胞核成熟率并改善早期胚胎發育。Lee等[35]研究顯示，ALA可通過激活MAPK信號通路促進卵母細胞核成熟、增加谷胱甘肽含量、促進卵母細胞胞質成熟。上述研究均證實，ω-3PUFAs可通過激活MAPK信號通路促進卵母細胞成熟及胚胎發育。

2.6ω-3PUFAs激活卵母細胞PPAR PPAR是一類多域蛋白質，屬于核受體超家族。PPAR作為重要的細胞核轉錄因子，可調節一系列參與糖、脂代謝及炎癥反應控制的相關基因的表達。PPAR主要包括3種亞型，即PPARα、PPARβ/δ和PPARγ。PPAR廣泛表達于生殖系統各類器官中，包括下丘腦、垂體、卵巢、子宮和睪丸[36]。PPAR可與天然配體長鏈脂肪酸結合并實現活化，其中ω-3PUFAs因具有更高的親和力，在微摩爾濃度下即可激活PPAR[37]。ω-3PUFAs可結合并誘導PPAR的構象變化，觸發包括脂肪酸β-氧化及生成等多種代謝過程中特定基因的表達和轉錄，有助于維持卵母細胞內脂質代謝的穩態[38]。Idrees等[39]研究表明，PPARδ的激活可顯著降低卵母細胞內脂質含量和氧化應激水平，維持脂肪酸分解與β-氧化過程的平衡，從而改善卵母細胞質量、胚胎發育及胚胎著床能力。此外，ω-3PUFAs激活PPAR可促進核因子κB的失活、增加抗氧化酶(如過氧化氫酶、超氧化物歧化酶或血紅素加氧酶-1)的表達、降低活性氧類水平，從而抑制炎癥反應，有利于卵母細胞成熟和胚胎發育[40]。另有研究顯示，PPARα缺失對小鼠生育能力無顯著影響，PPARβ/δ敲除小鼠在妊娠早期即出現胎盤畸形、胚胎死亡，而PPARγ可通過調節卵母細胞減數分裂成熟相關基因(如一氧化氮合酶)的表達促進卵母細胞成熟[41]。在豬胎盤早期形成過程中，PPARβ/δ和PPARγ的激活刺激滋養層細胞增殖，有助于胚胎著床及胎盤形成[42]。因此，ω-3PUFAs激活PPAR有利于卵母細胞成熟，改善早期胚胎發育，對胚胎植入及胎盤形成具有重要意義。

3 ω-3PUFAs在卵泡液中的作用

正常的母體代謝健康狀態對于保障成功的排卵、受孕和胚胎發育至關重要。Matorras等[43]首次研究人卵母細胞中脂肪酸的組成，結果發現，飽和脂肪酸是受精失敗卵母細胞中的最主要成分(79.22%)，其中硬脂酸(38.65%)和棕櫚酸(32.66%)最為豐富，單不飽和脂肪酸(14.27%)中油酸含量最高(9.77%)，PUFAs則只占總脂肪酸的6.50%，ω-6PUFAs∶ω-3PUFAs=7.73，EPA∶DHA≈5。但由于存在倫理等問題，臨床研究中直接獲取卵母細胞進行成分測定并不可行，而在輔助生殖技術開展過程中，卵泡液的獲取十分簡易；同時，母體血清代謝物的變化常反映在卵泡液中[44]，影響卵泡健康、卵母細胞成熟以及隨后的胚胎發育，因此卵泡液的組分分析是最常用的評估卵母細胞質量的生物學指標。O′Gorman等[45]用氣相色譜-質譜法分析體外受精患者卵泡液中PUFAs的含量發現，正常受精后卵裂組患者卵泡液中ALA和DHA水平均顯著高于未卵裂組患者，表明ω-3PUFAs可能是預測卵母細胞發育能力的潛在非侵入性標志物，有助于體外受精過程中卵母細胞的選擇。一項前瞻性隊列研究顯示，卵泡液與血清中的PUFAs濃度呈正相關，卵泡液中較高水平的油酸和EPA可提高卵母細胞發育能力，并可在一定程度上逆轉飽和脂肪酸對卵母細胞質量的不利影響，改善輔助生殖結局[46]。但是，Ruiz-Sanz等[8]研究發現，卵泡液中的脂肪酸譜隨著卵泡的生長發育而變化，ω-3PUFAs水平(特別是DHA水平)與女性年齡呈正相關，與獲卵數、受精率及優質胚胎率均呈負相關。以上研究結果的差異可能與研究人群納入標準、樣本量及檢測方法不同有關，未來仍需更多的研究證實ω-3PUFAs在卵泡液中的作用。總之，卵泡液中ω-3PUFAs水平有望成為預測卵母細胞質量的非侵入性手段，并可能為臨床改善卵母細胞質量的相關干預措施提供指導。

4 小 結

不同濃度、物種及亞型的ω-3PUFAs對女性生殖的影響存在差異。代謝組學是一門新興的尋找與疾病相關的生物標志物的研究方法，其因具有客觀、準確及測量相對簡單等優點而成為目前研究的熱點。因此，臨床上可以考慮使用代謝組學方法，在血清及不同人群卵母細胞發育的不同階段測定ω-3PUFAs水平及亞型分布的差異，探索其是否可以成為預測卵母細胞質量的生物標志物。同時，臨床ω-3PUFAs營養/藥物制劑干預對改善女性生殖健康的必要性以及ω-3PUFAs制劑中適宜的ALA、DHA和EPA含量及比例等問題也亟待解決。未來仍需更多的體內及體外實驗研究進一步證實ω-3PUFAs對卵母細胞成熟及發育潛能的影響及作用機制，以改善卵泡微環境并提高卵母細胞質量，最終改善女性生育能力。