促性腺激素釋放激素激動劑對子宮腺肌病病灶及子宮內膜Ki-67、VEGF、NGF 表達及神經纖維分布的影響

陳君霞 王運根 章英 孫麗萍

子宮腺肌病是一種良性子宮疾病，其定義為子宮內膜腺體及間質存在于子宮肌層內[1]，臨床表現為痛經、子宮異常出血、月經過多、不孕、流產等。在子宮腺肌病發展過程中，子宮內膜腺體和間質的植入需要細胞增殖和血管生成共同完成。另外，有研究發現腺肌病病灶神經纖維分布異常可能在子宮腺肌病疼痛發生機制中起重要作用[2-3]，子宮腺肌病患者疼痛的嚴重程度與子宮內膜和肌層神經纖維的增加密切相關，而與病變的程度無關[3]。目前普遍認為子宮腺肌病和子宮內膜異位癥有類似的發病機制，受相同的類固醇激素影響。短效口服避孕藥或孕激素治療均可明顯緩解子宮內膜異位癥患者的盆腔疼痛，且已證實這兩類藥物均可顯著降低子宮內膜異位癥患者子宮內膜和子宮肌層的神經纖維密度[4-5]。促性腺激素釋放激素激動劑（GnRHa）為人工合成的十肽類化合物，對促性腺激素釋放激素（GnRH）受體的親和力較天然GnRH高百倍，可持續抑制垂體分泌促性腺激素，導致卵巢激素水平明顯下降，是臨床上治療子宮腺肌病和子宮內膜異位癥的常用藥物。本研究探討GnRHa對子宮腺肌病患者子宮腺肌病病灶及子宮內膜細胞增殖、血管增殖、神經生長因子及神經纖維密度的影響，現報道如下。

1 對象和方法

1.1 對象 選取2014年1月至2020年6月紹興市人民醫院收治的因子宮腺肌病行經腹或腹腔鏡下子宮全切術的患者68例，患者年齡32～50（45.68±3.39）歲。納入標準：（1）患者年齡30～50歲，存在重度痛經[視覺模擬評分法（VAS）評分7～9分]，伴或不伴有月經量過多；（2）經臨床表現及陰道超聲檢查明確診斷為子宮腺肌病；（3）所有患者既往均無腹部手術史、盆腔炎性疾病史、神經性疼痛病史或內分泌疾病史。排除標準：就診前半年內接受過任何激素治療。68例患者中，有36例同時存在月經過多。在接受子宮切除術前，所有患者均被告知可選擇GnRHa預處理及相關的受益（縮小子宮體積有利于手術，緩解痛經，暫時性閉經改善貧血等）和可能出現的風險（低雌激素相關癥狀等）。權衡利弊后，其中36例患者選擇術前GnRHa預處理作為GnRHa治療組，另外32例患者選擇直接手術治療作為對照組。兩組患者年齡、孕次、產次、月經過多發生率等方面比較差異均無統計學意義（均P＞0.05），見表 1。

表1 兩組患者一般資料比較

GnRHa治療組患者于月經第1天給予皮下注射醋酸亮丙瑞林針3.75 mg（天津武田藥品有限公司，規格：3.75 mg/支），此后每隔4周注射1次，共3個周期，末次注射后1個月內接受子宮全切術；對照組患者術前不作處理。兩組患者行子宮全切除術后，迅速將切下子宮剖開，于子宮肌層尋找并切取子宮腺肌病病灶，同時切取子宮內膜組織，并將組織標本置于4%中性緩沖甲醛溶液中固定，4℃保存。子宮內膜為基底層子宮內膜，即距離內膜-肌層交界處300 μm以內的內膜組織。

1.2 方法

1.2.1 VAS評分評價疼痛程度 采用VAS評分評價子宮腺肌病患者痛經程度。VAS評分：0分為無痛；＞0分為疼痛，其中＞0分且＜7分為輕中度痛，≥7分為重度痛。

1.2.2 增殖細胞相關核抗原-67（Ki-67）、血管內皮生長因子（VEGF）、神經生長因子（NGF）、蛋白基因產物-9.5（PGP-9.5）表達情況檢測 采用免疫組化法。Ki-67：固定后的組織標本常規石蠟包埋，4 μm厚度連續切片，二甲苯和梯度乙醇常規脫蠟，0.01 mol/L檸檬酸鹽緩沖液（pH 6.0）中進行煮沸抗原修復，0.3%H2O2阻斷內源性過氧化物酶。將鼠抗人Ki-67單克隆抗體（M7240，中國上海基因生物科技有限公司，規格：0.2 ml，批號：GT209429，1∶200稀釋）滴加在組織玻片上，4 ℃孵育過夜。放大顯色系統采用EnVision試劑盒（丹麥DAKO公司，批號：20059650），操作方法按試劑盒說明書進行。3,3'-二氨基聯苯胺顯色，蘇木素復染。常規脫水，透明，干燥，封片，光學顯微鏡下觀察。

VEGF：固定及抗原修復步驟同上，滴加鼠抗人VEGF單克隆抗體（VG1，中國上海基因生物科技有限公司，規格：4 ml，批號：GT217004），操作方法按試劑盒說明書進行。復染及脫水、干燥等步驟同上。光學顯微鏡下觀察。

NGF：固定及抗原修復步驟同上，滴加單克隆兔抗人NGF抗體（EP1320Y，中國上海基因生物科技有限公司，規格：0.2 ml，批號：GR226375-44，1∶500 稀釋），操作方法按試劑盒說明書進行。復染及脫水、干燥等步驟同上。光學顯微鏡下觀察。

PGP-9.5：固定及抗原修復步驟同上，滴加兔抗人PGP-9.5多克隆抗體（Z5116，丹麥DAKO公司，規格：0.2 ml，批號：GZ511629，1∶500 稀釋），操作方法按試劑盒說明書進行。復染及脫水、干燥等步驟同上。光學顯微鏡下觀察。

1.2.3 檢測方法 Ki-67和VEGF染色評價：隨機選取3個視野，高倍鏡下（×400）計數陽性染色細胞個數及總細胞個數，計算陽性細胞占總細胞的比例，取其平均值。

NGF的染色評價：低倍鏡（×100）下選取NGF陽性高表達區，再轉換成高倍鏡（×400），通過免疫反應性（IR）評分評價，其中染色強度評分0分即陰性，1分即弱陽性，2分即中度染色，3分即強陽性；陽性染色細胞的百分比評分0分即0%細胞陽性染色，1分即≤10%細胞陽性染色，2分即11%～50%細胞陽性染色，3分即51%～80%細胞陽性染色，4分即≥81%細胞陽性染色。IR評分=染色強度評分×陽性染色細胞的百分比評分。

PGP-9.5陽性神經纖維密度計算：參考Tokushige等[6]的方法并加以改進。采用德國萊卡公司生產的顯微激光切割系統（型號：Leica DM3000）進行計數并拍片。神經纖維密度計算方法為：低倍鏡（×100）下選取PGP-9.5陽性高表達區，再轉換成高倍鏡（×400），進行圖像采集，計數5個高倍視野下PGP-9.5陽性神經纖維數，計算其平均值。每張片子由兩位互盲且對該病例臨床資料并不了解的課題組成員計數PGP-9.5陽性神經纖維個數，要求兩者計數結果差別＜5%。

1.3 統計學處理 采用SPSS 11.0統計軟件。符合正態分布的計量資料以表示，組間比較采用兩獨立樣本t檢驗；不符合正態分布的計量資料以M（P25，P75）表示，組間比較采用秩和檢驗。計數資料用率表示，組間比較采用χ2檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 兩組患者子宮不同組織Ki-67陽性細胞比例比較 GnRHa治療組和對照組患者子宮腺肌病病灶組織 Ki-67陽性細胞比例分別為（9.56±3.48）%和（44.53±10.02）%，差異有統計學意義（P＜0.05）；兩組子宮內膜組織Ki-67陽性染色細胞比例分別為（7.56±2.27）%和（43.66±9.87）%，差異有統計學意義（P＜0.05）。見圖 1（插頁）。

圖1 兩組患者子宮不同組織增殖細胞相關核抗原（Ki-67）免疫組化染色圖[a、b、c、d為子宮腺肌病病灶，e、f、g、h為子宮內膜組織；a、b、e、f為對照組，c、d、g、h 為促性腺激素釋放激素激動劑（GnRHa）治療組；a、c、e、g為 100 倍鏡下觀，b、d、f、h 為 400 倍鏡下觀]

2.2 兩組患者子宮不同組織VEGF陽性細胞比例比較 GnRHa治療組和對照組患者子宮腺肌病病灶組織VEGF陽性細胞比例分別為（6.06±1.71）%和（10.09±2.43）%，差異有統計學意義（P＜0.05）；兩組子宮內膜組織VEGF陽性染色細胞比例分別為（6.86±2.28）%和（7.69±2.84）%，差異無統計學意義（P＞0.05）。見圖 2（插頁）。

圖2 兩組患者子宮不同組織血管內皮生長因子（VEGF）免疫組化染色圖[a、b、c、d為子宮腺肌病病灶，e、f、g、h為子宮內膜組織；a、b、e、f為對照組，c、d、g、h 為促性腺激素釋放激素激動劑（GnRHa）治療組；a、c、e、g為 100 倍鏡下觀，b、d、f、h 為 400 倍鏡下觀]

2.3 兩組患者子宮不同組織NGF表達的IR評分比較 GnRHa治療組和對照組患者子宮腺肌病病灶組織IR評分比例分別為3.92±1.20和6.84±2.68，差異有統計學意義（P＜0.05）；在子宮內膜部位，兩組IR評分比例分別為2.78±1.57和5.66±2.81，差異有統計學意義（P＜0.05）。見圖 3（插頁）。

圖3 兩組患者子宮不同組織神經生長因子（NGF）免疫組化染色圖[a、b、c、d 為子宮腺肌病病灶，e、f、g、h 為子宮內膜組織；a、b、e、f為對照組，c、d、g、h 為促性腺激素釋放激素激動劑（GnRHa）治療組；a、c、e、g 為 100 倍鏡下觀，b、d、f、h 為 400 倍鏡下觀]

2.4 兩組患者子宮不同組織PGP-9.5陽性神經纖維密度比較 GnRHa治療組和對照組患者子宮腺肌病病灶組織PGP-9.5陽性神經纖維密度分別為1（1，2）和 3（2，4），差異有統計學意義（P＜0.05）；兩組子宮內膜組織PGP-9.5陽性神經纖維密度分別為 1（1，2）和 2（1，3），差異有統計學意義（P＜0.05）。見圖 4（插頁）。

圖4 兩組患者子宮不同組織蛋白基因產物-9.5（PGP-9.5）免疫組化染色圖[a、b、c、d為子宮腺肌病病灶，e、f、g、h為子宮內膜組織；a、b、e、f為對照組，c、d、g、h 為促性腺激素釋放激素激動劑（GnRHa）治療組；a、c、e、g 為 100 倍鏡下觀，b、d、f、h 為 400 倍鏡下觀]

3 討論

臨床研究表明，目前在各種藥物保守治療方法中，GnRHa在緩解子宮腺肌病患者痛經、減少子宮腺肌病病灶體積、減少月經量等方面的療效最強[7]。一般認為，GnRHa的作用是通過競爭性下調垂體GnRH受體，抑制卵巢功能導致低雌激素狀態，從而緩解疼痛，縮減病灶大小。然而，越來越多的證據表明GnRHa對子宮腺肌病或子宮內膜異位癥患者的病灶和子宮內膜組織均存在直接的作用[8-11]，而本研究進一步證實了GnRHa在人體內對子宮腺肌病病灶部位和子宮內膜組織學的影響。

Ki-67與細胞增殖有關，體外研究表明，GnRHa可降低子宮腺肌病患者子宮肌層中Ki-67的表達[9]。VEGF是病理生理條件下血管生成的主要促進因子，也是內皮細胞的生存因子[12]。VEGF的釋放與子宮腺肌病的發生有關，而體外研究發現GnRHa可通過減少VEGF的釋放直接抑制異位子宮內膜的存活和生長[13]，因此筆者推測在體內也有類似的結果。PGP-9.5是一個泛神經纖維標志物，可標記有髓和無髓鞘的神經纖維[14]。依據以往的研究[4-5]，筆者假設GnRHa可以抑制細胞增殖，減少血管生成，并減少病變組織和子宮內膜的神經纖維密度。在本研究中，筆者使用Ki-67、VEGF、NGF、PGP-9.5 進行免疫組化染色，分析GnRHa作用下子宮腺肌病患者病灶部位和子宮內膜的細胞增殖、血管增殖及神經纖維密度變化。

本研究結果顯示，GnRHa治療組患者子宮腺肌病病灶和子宮內膜組織Ki-67陽性細胞比例均較對照組顯著降低，說明GnRHa可降低子宮腺肌病患者子宮組織中細胞的增殖，這解釋了GnRHa在減少子宮腺肌病患者子宮體積方面的顯著作用。而新生血管生成受抑制或許也是GnRHa治療縮小子宮腺肌病子宮體積的原因。根據以往的研究，VEGF在血管和神經發生過程中起重要作用，其在子宮腺肌病患者的在位和異位子宮內膜中均有強烈表達[15]。外源性VEGF-A可促進接受過去神經手術成年大鼠交感神經突的生長[16]。本研究發現，GnRHa治療組的子宮腺肌病病灶VEGF表達明顯低于對照組，提示GnRHa治療可顯著抑制子宮腺肌病病灶血管增殖，從而抑制該部位異位內膜的生長。雖然GnRHa治療組的子宮內膜組織VEGF表達較對照組降低并不顯著，但筆者仍然推測GnRHa可以減少該部位的新生血管形成，差異無統計學意義的原因可能是本研究中Gn－RHa治療組沒有經過足夠的周期治療，本研究Gn－RHa治療組在子宮切除前僅用GnRHa治療了3個周期。關于GnRHa對子宮腺肌病組織血管再生的影響，還需要進行更多的研究。

GnRHa治療組組織中NGF表達及PGP-9.5陽性神經纖維密度均顯著低于對照組，這些發現可能揭示了GnRHa控制腺肌癥相關疼痛的機制。據文獻報道，神經重塑和神經纖維分布改變可能是導致子宮腺肌病相關疼痛的原因，而NGF在神經重塑和神經纖維分布中起重要作用[17]。據報道，在子宮內膜異位病灶中，NGF表達異常增高[18-19]，并且在子宮內膜異位病灶中，疼痛組患者的PGP-9.5陽性神經纖維明顯高于無痛組[20]。既往研究顯示地諾孕素可降低子宮內膜異位病灶的NGF表達強度，同時減少病灶神經纖維密度[5]。本研究結果發現，與對照組相比，GnRHa治療組子宮腺肌病病灶及子宮內膜中NGF的IR評分及PGP-9.5陽性神經纖維密度均明顯降低，這可能是GnRHa減輕子宮腺肌病相關疼痛癥狀的機制之一，提示GnRHa可能直接作用于子宮腺肌病病灶內的神經系統。

總之，本研究結果表明，GnRHa治療后子宮腺肌病病灶和子宮內膜具有顯著的組織學特征，包括細胞增殖和血管增生減少，NGF的IR評分比例降低以及PGP-9.5陽性神經纖維密度降低。當然，對于GnRHa對子宮腺肌病中血管生成的影響，還需要更多的周期研究。事實上，GnRH受體在子宮內膜異位、子宮腺肌病和子宮肌瘤等外周組織中均有表達[9，21]。體外實驗顯示GnRHa可抑制子宮內膜異位癥細胞增殖，提示GnRHa可能對子宮內膜異位癥病灶有直接作用[10]。除了雌激素抑制的間接作用之外，GnRHa對子宮腺肌病病灶及子宮內膜組織是否存在直接作用，本研究所顯示的這些變化究竟是GnRHa的直接影響，還是雌激素的繼發性改變，亦或兼而有之，目前尚不清楚，需要進一步的前瞻性研究來克服這些局限性。