血清miRNA-16和miRNA-92a在2型糖尿病合并骨質疏松癥患者中的表達及與骨代謝相關性研究

丁莉 彭健韞 張偉 陳日秋

近年來，我國2型糖尿病（T2DM）合并骨質疏松癥發病率呈不斷上升趨勢。因此，探討T2DM合并骨質疏松癥的發病機制對臨床診治具有重要意義。miRNA是在轉錄后參與細胞增殖、凋亡及分化等過程的一種小型非編碼RNA，存在于多種生物體內。研究報道顯示，miRNA參與骨微環境中的骨吸收或骨生成[1-2]。本研究探討血清miRNA-16和miRNA-92a在T2DM合并骨質疏松癥患者中的表達及與骨代謝的相關性，以期為臨床診斷和治療T2DM合并骨質疏松癥提供參考，現報道如下。

1 對象和方法

1.1 對象 選取麗水市人民醫院2019年1月至2021年1月收治的T2DM合并骨質疏松癥患者91例作為T2DM合并骨質疏松組，納入標準：（1）符合《中國2型糖尿病防治指南（2013年版）》[3]中關于T2DM的診斷標準以及《中國人骨質疏松癥建議診斷標準》[4]中關于骨質疏松癥的診斷標準；（2）年齡40～75歲；（3）臨床資料完整。排除標準：（1）1型糖尿病或其他骨科疾病者；（2）精神疾病者；（3）合并影響骨代謝疾病者。另選取本院同期收治的單純T2DM患者80例作為非骨質疏松組，依據《中國2型糖尿病防治指南（2013年版）》[3]關于T2DM診斷標準。兩組患者基線資料比較差異均無統計學意義（均P＞0.05），見表1。本研究經本院醫學倫理委員會批準，所有患者及家屬均知情同意。

表1 兩組患者基線資料比較

1.2 主要試劑和儀器 主要試劑：Ⅰ型膠原羧基端肽β特殊系列（β-CTX）試劑盒購自上海江萊生物科技有限公司，堿性磷酸酶（ALP）試劑盒購自上海江萊生物科技有限公司。主要儀器：實時熒光定量PCR儀購自美國ABI公司，電化學發光全自動免疫分析儀購自瑞士羅氏公司。

1.3 血清miRNA-16和miRNA-92a表達水平檢測 （1）miRNA提取、純化和定量分析：采集受試者外周靜脈血5 ml，15 000 r/min離心6 min，收集血清后于4℃12 000 r/min離心6 min，再收集血清置于-70℃保存待測。（2）血清miRNA-16和miRNA-92a相對表達量測定：取上述血清標本，采用TRIzol試劑提取血清總RNA，取5 μl總RNA進行瓊脂糖凝膠電泳并檢測總RNA的純度和完整度。按照美國Biomiga公司逆轉錄試劑盒使用說明書將其逆轉錄為cDNA，以U6作為內參基因。取cDNA進行qRT-PCR，反應條件：95 ℃預變性 10 min，95 ℃ 15 s、60 ℃ 1 min，共完成40個循環，每個樣品設置3個復孔。采用2-ΔΔCt法計算miRNA-16和miRNA-92a相對表達量。引物序列由上海生工生物工程有限公司合成，引物序列見表2。

表2 引物序列

1.4 血清骨代謝指標測定 采集兩組患者外周靜脈血 5 ml，15 000 r/min離心 6 min，取上清液（血清）置于-70℃下保存待測。采用電化學發光免疫分析法測定Ⅰ型膠原羧基端肽β特殊系列（β-CTX）和ALP水平，嚴格依據試劑盒說明書進行操作。

1.5 統計學處理 采用SPSS 25.0統計軟件。計量資料以表示，組間比較采用兩獨立樣本t檢驗；計數資料用率表示，組間比較采用χ2檢驗。采用ROC曲線分析miRNA-16和miRNA-92a對T2DM合并骨質疏松癥的診斷效能；采用Pearson相關分析miRNA-16、miRNA-92a與骨代謝的相關性；多因素logistic回歸分析影響T2DM合并骨質疏松的獨立危險因素。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 兩組miRNA-16和miRNA-92a相對表達量比較 T2DM合并骨質疏松組miRNA-16和miRNA-92a相對表達量均明顯高于非骨質疏松組，差異均有統計學意義（均 P＜0.05），見表 3。

表3 兩組miRNA-16和miRNA-92a相對表達量比較

2.2 兩組β-CTX、ALP水平比較 T2DM合并骨質疏松組β-CTX水平高于非骨質疏松組，而ALP低于非骨質疏松組，差異均有統計學意義（均P＜0.05），見表4。

表4 兩組β-CTX、ALP水平比較

2.3 miRNA-16和miRNA-92a對T2DM合并骨質疏松癥的診斷效能 診斷T2DM合并骨質疏松癥時，miRNA-16靈敏度為71.70%，特異度為55.26%；miRNA-92a靈敏度為69.35%，特異度為58.62%。見表5和圖1。

表5 miRNA-16和miRNA-92a對T2DM合并骨質疏松癥的診斷價值

圖1 miRNA-16和miRNA-92a診斷2型糖尿病（T2DM）合并骨質疏松癥的ROC曲線

2.4 miRNA-16、miRNA-92a與 β-CTX、ALP 的相關性 miRNA-16、miRNA-92a與 β-CTX均呈正相關（均 P＜0.05），而與 ALP均呈負相關（均P＜0.01）。見表6。

表6 miRNA-16、miRNA-92a與β-CTX、ALP的相關性

2.5 影響T2DM合并骨質疏松的獨立危險因素 經多因素logistic回歸分析顯示，年齡＞60歲、miRNA-16和miRNA92表達均為影響T2DM合并骨質疏松的獨立危險因素（均P＜0.05）。見表7。

表7 多因素logistic回歸分析影響T2DM合并骨質疏松的獨立危險因素

3 討論

骨質疏松癥是我國中老年人常見的一種疾病，其特征主要為骨干質量的改變、骨骼的退化，伴機械負荷能力減弱及骨骼硬度下降[5-6]。T2DM合并骨質疏松癥者發生骨折概率較高，具有較高致殘率和致死率，對患者生活質量造成嚴重影響[7-9]。

正常機體骨代謝處于吸收和形成相對動態平衡的一種狀態，骨代謝標志物包括骨吸收與骨形成標志物兩部分，因此檢測骨代謝水平可有效、及時地反映骨吸收和骨形成的速率，實現對骨質疏松癥的篩查和診療[9]。β-CTX是重要的一種骨吸收標志物，能夠反應破骨細胞的狀態，骨質疏松癥患者骨吸收增強，會使破骨細胞活性上升，β-CTX水平隨之升高[10]。ALP主要源自于成骨細胞，對骨形成和骨礦化均發揮重要作用，且是骨形成和骨轉化的重要生化標志[11]。本文研究發現，T2DM合并骨質疏松組患者血清β-CTX高于非骨質疏松組，而ALP低于非骨質疏松組，提示T2DM合并骨質疏松癥患者存在骨代謝異常。

miRNA具有19～22個核苷酸，主要通過降解靶mRNA調控生命過程的小分子RNA來參與增殖、分化及凋亡等生物過程。近年來，miRNA在骨質疏松癥和退行性骨關節疾病的發生、發展中的影響研究成為熱點[12-14]。研究發現，miRNA作為調節細胞凋亡過程的重要成員，其對關節軟骨細胞和軟骨基質的代謝及骨質疏松癥的發生、發展具有一定的影響[15]。越來越多研究強調了miRNA在調節骨髓間充質干細胞、破骨細胞及成骨細胞的功能和分化方面的作用，且認為miRNA通過Wnt信號通路、轉化生長因子-β及骨形態發生蛋白來促進間充質干細胞向成骨細胞分化以及骨形成，但因miRNA不能抵御核酸酶，且缺乏靶向性，故而以支架為基礎的miRNA載體在難治性骨質疏松性骨折的骨修復中具有特殊的應用前景[16]。而目前臨床上對miRNA-16和miRNA-92a在T2DM合并骨質疏松癥中研究甚少，且尚無有關miRNA-16和miRNA-92a與骨代謝相關研究，缺乏可靠的參考依據，故而還需后續增加樣本量，作多中心、多樣本深入研究，提供可靠的臨床參考價值。本研究發現，T2DM合并骨質疏松組血清miRNA-16和miRNA-92a相對表達量高于非骨質疏松組，由此可見T2DM合并骨質疏松癥患者血清miRNA-16和miRNA-92a呈高表達。同時，本研究發現，T2DM合并骨質疏松癥中，miRNA-16診斷靈敏度為71.70%，特異度為55.26%；miRNA-92a診斷靈敏度為69.35%，特異度為58.62%，由此可見血清miRNA-16和miRNA-92a在T2DM合并骨質疏松癥中具有良好診斷價值；且miRNA-16和miRNA-92a與β-CTX呈線性正相關，而與ALP呈線性負相關。

綜上所述，血清miRNA-16和miRNA-92a在T2DM合并骨質疏松癥中高表達，且與骨代謝明顯相關。