代謝組學在癲癇相關研究中的應用現狀

龔雪，周東，洪楨

(四川大學華西醫院神經內科，成都610041)

癲癇的發病由多因素共同參與，導致癲癇發作的關鍵性因素目前尚不明確，因此癲癇發作是一種不可控制、不可預測的狀況［1］。盡管目前已有20多種抗癲癇藥物應用于臨床，但仍有約1/3的癲癇患者對藥物治療無效［2］。抗癲癇藥物治療效果不佳的原因可能是個體之間在藥物代謝學、藥效學、病理生理學基礎方面存在較大差異［3］。另外，在抗癲癇藥物的使用過程中還可發生多種嚴重、不可逆的不良反應［4］。因此，尋找新的特異性生物標志物迫在眉睫。而確定致癇靶點可有助于新藥的研發，增加患者服藥的依從性，同時減少藥物不良反應。代謝組學是一種高通量、高靈敏度的檢測技術，主要針對體液、組織、細胞等生物體中分子量＜1 000的小分子代謝物質進行分析［5－6］。代謝組學的變化可以直接或間接反映外界刺激或遺傳修飾對生物體代謝應答的改變，因此代謝組學研究可以將遺傳、環境和生理因素與特定的病理狀態聯系起來［6－7］。目前代謝組學檢測技術已成為研究多種疾病潛在病理生理機制的重要手段［7－9］。癲癇發作后機體組織及循環系統內的微小變化均可反映在代謝物質水平上，因此代謝組學檢測技術也可用于癲癇的研究。現就代謝組學在癲癇相關研究中的應用現狀予以綜述。

1 代謝組學研究概述

目前，核磁共振和質譜是代謝組學研究的兩種主要分析平臺。核磁共振通常用于鑒定組織代謝物，其具有樣品制備簡單(無需對樣品提取、衍生化、分離且對樣本無創)、分析時間短、信號穩定、可對代謝物進行絕對定量等優點，但靈敏度較低，無法檢測出低豐度的代謝物質，導致檢測覆蓋范圍局限［10］。同時，儀器成本昂貴限制了核磁共振的廣泛應用［7］。

氣相色譜－質譜法具有高分離能力、標準譜圖庫對比以及低儀器成本等優點［11－13］，在代謝組學研究中被廣泛應用。氣相色譜－質譜法檢測的代謝產物主要與三羧酸循環、糖酵解、尿素循環、氨基酸代謝、脂肪酸代謝等途徑相關。近年來，基于氣相色譜－質譜法的快速、高靈敏度的檢測方法被用于短鏈和中鏈脂肪酸的定量檢測，是研究腸道微生物群落參與代謝途徑的有效工具［14］;同時，也被用于研究神經遞質［15］、激素和嘌呤代謝［16］失衡在不同神經系統疾病中的潛在作用。液相色譜－質譜法也是代謝組學研究中廣泛應用的分析平臺，其與氣相色譜－質譜法互為補充，可增加復雜生物樣品代謝物質的檢測信息［17］。例如，二維液相色譜－質譜法可在一次操作過程中同時分析代謝組和脂質組，這是一種對有限的生物樣本量進行大規模代謝組學研究的有效檢測工具［18］。

非靶向和靶向性分析是代謝組學研究的兩種主要策略［19］。非靶向代謝組學具有較好的代謝物檢測覆蓋率，但對低豐度代謝物質的檢測重現性較差，且靈敏度低，同時需要對樣品進行分離，因此對樣品具有破壞性［20］。而靶向代謝組學具有靈敏度高、動態檢測范圍廣以及定量結果準確率高等特點，被視為代謝物定量分析的金標準［21］。

雖然以上技術均能同時定量樣本中共存的多種代謝物，但仍不能覆蓋整個代謝組，只有多個分析平臺聯合應用，才能提高代謝組學研究的覆蓋率。

2 代謝組學在人類癲癇相關研究中的應用

近年來，關于代謝組學與神經系統疾病相關性的研究不斷發展。代謝途徑的異常可能參與多種神經及精神疾病的發生，包括帕金森病［22］、阿爾茨海默病［23］、多發性硬化［24］以及腦卒中［9，25］等。目前的癲癇動物模型及癲癇患者與代謝組學的相關研究表明，在癲癇發作時多種代謝產物及代謝途徑發生紊亂［26－27］，但人類代謝組學研究受遺傳變異及其他混雜因素的影響較大，如藥物、飲食和共病等。大部分代謝組學與癲癇的相關研究是基于對患者腦脊液、腦組織、血液、尿液、糞便樣本進行分析。靶向研究的方法主要用于檢測研究人員感興趣的代謝物，如類固醇類激素、支鏈氨基酸、兒茶酚胺、嘌呤和尿酸鹽等，而非靶向代謝組學則廣泛應用于癲癇的研究，用于識別新的生物標志物。

2.1 人類腦脊液代謝組學 腦脊液代謝成分異常可直接反映腦部的病理生理變化，因此腦脊液成為神經病理學研究的首選生物樣本。目前發現神經細胞膜離子通道(如編碼鈉離子通道α亞基［28］、編碼電壓門控鉀通道亞基Kv7.2［29］基因突變)、神經遞質及其受體(如γ－氨基丁酸A受體β亞基［30］和膽堿能受體煙堿α2亞基［31］)以及線粒體(如線粒體精氨酰轉運RNA合成酶2［32］)功能紊亂均參與癲癇的發病;另外，過量的興奮性氨基酸(如谷氨酸)積聚在細胞外，導致大量的鈣離子通過N－甲基－D－天冬氨酸受體通道進入細胞內，繼而誘發癲癇［33］。上述研究為測定腦脊液中與能量代謝相關的代謝物(或神經遞質)并發現可靠的生物標志物提供了重要依據。

Bainbridge等［34］證明，SLC13A5(sodium－citrate cotransporter)基因突變的癲癇患者腦脊液與血液中代謝物質的重疊度相對較高，研究者使用非靶向質譜檢測方法對SLC13A5基因突變癲癇患者的腦脊液代謝產物進行分析后發現，檸檬酸鹽豐度顯著升高且檸檬酸循環途徑的中間產物失調，如丙二酸鹽、烏頭酸、檸檬酸二甲酯、異檸檬酸鹽豐度顯著增加，而3－羥基丁酸酯、磷酸膽堿、琥珀酰亞胺水平顯著降低，此結果進一步支持了SLC13A5基因功能喪失可改變三羧酸循環代謝通路，使大腦代謝過程發生紊亂進而誘發癲癇的假設。Akiyama等［35］應用氣相色譜－質譜法分析法發現，0～5歲癲癇患兒腦脊液中的2－酮戊二酸水平顯著降低，同時吡哆胺和酪氨酸豐度顯著升高;6～17歲癲癇患者腦脊液中的1，5－脫水葡萄糖醇豐度顯著降低。由此推測，能量代謝降低和維生素B6代謝異常可能是小兒癲癇發生的潛在致病因素。2017年國際抗癲癇聯盟共識指南提出了“免疫性癲癇”這一概念［36］，而近年研究發現，自身免疫性癲癇患者腦脊液中存在特殊的代謝網絡，且與健康對照者之間的主要差異在于酮體的合成與降解，因此認為酮體代謝過程中產生的乙酰乙酸和乙酰胺可作為自身免疫性癲癇的潛在診斷標志物;另外，谷氨酰胺水平升高與疾病狀態下氨基酸代謝紊亂有一定關系，提示癲癇發時腦脊液中的蛋白質、核酸合成減少;而且谷氨酰胺在谷氨酸－谷氨酰胺循環的遞質傳遞中起重要作用，其含量改變會影響神經系統的興奮性，這也是癲癇的發病機制之一［37］。

2.2 人類血清代謝組學 在臨床工作中，由于血漿/血清的生物樣本較腦脊液更易獲取，針對癲癇與血清代謝組學相關性的研究較多［27，34，38－40］。癲癇患者與健康人群血清/血漿中的差異代謝物可分為氨基酸、脂肪酸、酰基肌醇、脂質、嘌呤、有機酸以及糖類物質等，而上述物質是支鏈氨基酸代謝、色氨酸代謝、脂質代謝、能量代謝、嘌呤代謝以及氧化應激/氧化還原等代謝途徑中的重要代謝產物。研究證實，癲癇患者血清/血漿中的谷氨酸和乳酸豐度均顯著上調，檸檬酸豐度則顯著下調［27，38－39］。乳酸在許多生化反應過程中起重要作用，特別是在丙酮酸代謝過程中。γ－氨基丁酸的減少和谷氨酸的增加在癲癇發病中也具有重要作用。Wang等［27］證實，血清乳酸、甘油醛和反式－13－十八碳烯酸聯合診斷48 h內癇性發作的準確率高達92.9%。除研究癲癇與健康人群血清代謝物質的差異外，還有研究對不同臨床表現的癲癇患者進行亞組分析。Al Zweiri等［40］收集癲癇患者藥物治療前的血清樣本，并應用核磁共振聯合質譜法進行分析，結果發現，未進行藥物治療的癲癇患者血清樣本中不包含可預測抗癲癇藥物療效的生物標志物。然而，一項根據血清代謝組學分析的研究結果表明，藥物難治性、藥物敏感性癲癇患者以及健康者血清中的代謝物質顯著不同，其中藥物難治性癲癇患者血清中3－羥基丁酸鹽、2－羥基戊酸鹽、2－羥基丁酸鹽、乙酰乙酸鹽、丙酮、乙酸鹽、膽堿、丙氨酸、谷氨酸鹽、乳酸等物質的水平顯著升高，而葡萄糖、檸檬酸鹽的水平則顯著降低［38］。因此，血清代謝組學可作為優化患者治療方案和提高患者生活質量的重要工具。

2.3 人類尿液及糞便代謝組學 由于尿液樣本的易得性和無創性，其成為臨床分析生物標志物的理想樣品來源。有研究表明，SLC13A5突變型癲癇患者尿液中的丙酮酸代謝失調［34］，而丙酮酸具有保護細胞及組織的功能［41－42］，可為細胞提供能量，調節體內糖代謝紊亂，具有抑制糖基化反應、抗氧化應激等作用［42］。另外，丙酮酸鹽水平降低通常也提示患者能量代謝增強［41］。另有研究發現，2－哌啶－6羧酸鹽、6－氧阿片酸鹽和哌啶酸鹽是醛脫氫酶7A1突變型癲癇的潛在診斷生物標志物［43］。因此，為了更好地了解癲癇患者尿液樣本中總體代謝物質及代謝途徑的改變，需要更多大樣本相關研究進行驗證。

另外，腸道微生物群在多種神經系統疾病(包括癲癇)的發生中起重要作用。糞便代謝組學研究可以提供宿主、飲食以及腸道微生物間相互作用的代謝信息，為探索微生物群代謝與宿主代謝之間的聯系提供了新途徑。目前糞便代謝組學已廣泛應用于多種疾病生物標志物的識別和功能注釋的研究，包括腸易激綜合征［44］、非酒精性脂肪肝［45］、心血管疾病［46］、糖尿病［47］、帕金森病［48］以及自閉癥［49］等，但糞便代謝組學研究方法尚未應用于癲癇的研究。因此，未來亟待更多關于糞便代謝組學與癲癇相關性的研究，探索腸道微生物群通過改變代謝產物導致代謝途徑異常，繼而影響癲癇的病理生理機制。

2.4 人腦組織代謝組學 人類腦組織的代謝組學研究主要基于核磁共振技術，核磁共振技術可快速、準確地檢測活體特定區域的生化成分，且最大限度地減少組織破壞。Detour等［50］發現，谷氨酰胺和谷氨酸是鑒別診斷海馬硬化與非海馬硬化癲癇患者的標志物，與海馬硬化癲癇患者相比，非海馬硬化癲癇患者的N－乙酰天冬氨酸及其相關代謝途徑中關鍵代謝產物的水平更高，如磷脂代謝途徑代謝產物(甘油磷酸膽堿、磷膽堿和總膽堿等)和某些特定氨基酸代謝途徑產物(如抗壞血酸、牛磺酸和谷胱甘肽)。有學者發現，高頻率的癲癇發作與醋酸、丙氨酸、肌酸、谷氨酰胺、牛磺酸、甘油磷酸膽堿以及纈氨酸水平升高相關［51］。使用高分辨魔角旋轉核磁共振法可更靈敏地發現常規影像學檢測手段無法發現的致癇灶，為患者手術提供精準定位、定性診斷。

3 代謝組學在癲癇動物模型中的相關研究

雖然目前已經建立了多種癲癇動物模型，但只有少數動物模型被用于代謝組學研究。主要的動物模型包括毛果蕓香堿誘導的癲癇持續狀態小鼠模型、紅藻氨酸大鼠模型以及遺傳缺失癲癇大鼠模型，通過這些動物模型研究鑒定的代謝物質主要來源于腦組織(全腦或特定區域)，其能更好地反映病灶部位的病理生理變化。Fauvelle等［52］研究發現，遺傳缺失癲癇大鼠模型腦組織中谷氨酸－谷氨酰胺－γ－氨基丁酸、牛磺酸－磷酸乙醇胺水平均顯著降低，這也為研究牛磺酸和磷酸乙醇胺可能具有減少癲癇發作的作用提供了新的理論假設。通過對慢性期毛果蕓香堿癲癇持續狀態小鼠模型的代謝組學分析，發現海馬中三羧酸循環途徑中關鍵酶活性顯著降低［53］，表明海馬硬化癲癇患者的海馬結構中可能存在三羧酸循環途徑紊亂。

顳葉癲癇是一種常見的繼發性癲癇，其特征是在腦損傷后存在自發性癲癇發作和無癲癇發作的潛伏期。有研究利用基于液相色譜－質譜法的脂質組學方法對顳葉癲癇小鼠模型的腦組織進行分析，結果發現脂質、嘌呤、固醇代謝以及大腦和血清中的維生素D3代謝產物可作為癲癇發生和預測致癇灶損傷嚴重程度的代謝生物標志物［54］。以上研究為顳葉癲癇的早期特異性診斷提供了可能，有助于因急性創傷所致慢性癲癇的靶向藥物的研發。

4 代謝組學在抗癲癇藥物中的研究

研究表明，生酮飲食和中鏈脂肪酸等可能通過改變能量及線粒體代謝、改變多不飽和脂肪酸的細胞氧化活性以及調節神經保護因子等機制發揮抗癲癇作用［55］。McDonald等［56］通過研究中鏈脂肪酸(三辛酸和三庚酸)喂養對小鼠海馬結構中葡萄糖代謝和三羧酸循環代謝的影響，發現海馬結構中的葡萄糖利用率顯著降低，由此推測，中鏈三酰甘油可能通過糾正戊糖磷酸、糖酵解和三羧酸循環代謝途徑紊亂而發揮抗癲癇的作用。

犬尿氨酸代謝途徑是指將色氨酸氧化為煙酰胺，進而轉化為煙酰胺腺嘌呤二核苷酸［57］。犬尿氨酸被認為是參與中樞神經系統疾病發生、發展的多種途徑的中間代謝產物，如參與谷氨酸和煙堿受體的調節、炎癥反應以及氧化應激等［58］。Heischmann等［59］報道，生酮飲食可通過調節犬尿氨酸的代謝途徑起到抗癲癇作用，這不僅為研究癲癇發病機制提供了潛在的生物標志物，還為治療癲癇提供了新的治療策略。

丙戊酸鈉屬于經典的抗癲癇藥物，是臨床常用的抗癲癇藥物之一，具有廣譜、價廉等優點。丙戊酸鈉也可用于雙向情感障礙等精神疾病的治療［60］。然而，有數據表明，使用丙戊酸鈉治療的癲癇患者會出現多種不良反應［61］，尤其是對肝臟的毒性［62］。目前的生化指標如丙氨酸轉氨酶、天冬氨酸轉氨酶等多反映肝臟組織損傷的晚期階段，因此亟須更加靈敏、有效的標志物評估肝臟的早期損害。Huo等［63］通過對癲癇患者血清進行代謝組學研究，發現丙戊酸鈉所致的異常肝功能與正常肝功能患者的血清代謝組有顯著差異，且該研究發現了與丙戊酸鈉致肝毒性相關的代謝標志物，如乳酸、乙酰乙酸、膽堿、肌酸、N－乙酰糖蛋白、丙酮酸以及尿酸等。Chen等［64］研究發現，丙戊酸鈉誘導的肝毒性癲癇患兒血清中的脂肪酸水平、檸檬酸循環、尿素循環、氨基酸代謝以及膽汁酸途徑均發生了改變。有研究應用丙戊酸鈉誘導孕期第9.5天健康母鼠，結果發現，丙戊酸鈉可能通過干擾胚胎中的嘌呤和嘧啶代謝產生致畸作用［65］，但丙戊酸鈉的致畸作用機制目前尚不明確。

5 展 望

雖然代謝組學研究平臺及方法取得了一定進展，但目前代謝組學在癲癇相關領域的研究仍處于探索階段，且代謝組學數據庫還需要進一步完善。因此，未來仍需通過更加嚴謹科學的研究方法排除多種混雜因素，獲得可真正用于臨床的轉化醫學成果。同時，還應聯合多種分析平臺及多部位生物樣本進行代謝組學研究，獲得全面的信息，以揭示代謝組學與癲癇發病的相關異常代謝通路。另外，微生物群失調和微生物代謝紊亂與癲癇的發病密切相關［25］。腸道中也存在參與腦功能調節的代謝物，且其濃度可由腸道微生物群進行調節，進而影響神經元的功能［66］。代謝組學與其他組學技術(如宏基因組學、蛋白質組學、轉錄組學)的聯合應用可更好地揭示宿主與內源、外源因素相互作用的機制［67－68］，為癲癇潛在的發病機制、診斷、預后及有效治療提供新的生物標志物。