炎性腸病與線粒體自噬的相關研究進展

吳闖，韓昌鵬，汪慶明，張海巖

(1.上海市寶山區中西醫結合醫院肛腸科，上海201999;2.上海中醫藥大學附屬岳陽中西醫結合醫院肛腸科，上海200437)

炎性腸病(inflammatory bowel disease，IBD)主要包括潰瘍性結腸炎(ulcerative colitis，UC)和克羅恩病(Crohn＇s disease，CD)。UC和CD均是由腸道特異性免疫調節異常導致的炎癥性疾病，且病程纏綿，極易反復，難以治愈。研究發現，腸道黏膜屏障損傷及炎癥的發生機制均與線粒體自噬密切相關［1］。線粒體自噬是指細胞在受到活性氧類(reactive oxygen species，ROS)、細胞衰老、營養缺乏或者細菌、病毒感染等刺激后，細胞內線粒體通過去極化清除多余或受損線粒體的過程。線粒體的功能障礙可促進炎癥的發生、氧化應激并誘導細胞凋亡［2］。其中，ROS和核苷酸結合寡聚化結構域樣受體蛋白3(nucleotide－binding oligomerization domain－like receptor protein 3，NLRP3)炎癥小體與線粒體自噬在UC中的作用已被證實［3］。UC和CD的多個易感基因位點均與線粒體自噬密切相關［4］。藥物治療IBD可能通過調控線粒體自噬起作用［5］。目前關于CD與線粒體自噬的研究較少，但自噬相關基因多態性與CD的發病確實存在聯系。線粒體DNA(mitochondrial DNA，mtDNA)突變對線粒體自噬的影響以及線粒體自噬、mtDNA對IBD炎癥的發生和免疫紊亂的作用也受到越來越多的關注。現就IBD與線粒體自噬的相關研究進展予以綜述。

1 線粒體自噬概述

1.1 線粒體功能 線粒體是真核細胞進行氧化代謝的場所，也是一種可控制細胞代謝、信號轉導、分化、生長、凋亡和死亡的重要細胞器，可通過三羧酸循環、氧化磷酸化產生ATP為細胞提供能量，也能儲存鈣離子調控膜電位，控制細胞凋亡。線粒體是產生ROS的主要亞細胞結構，有10多個位點［6］;線粒體ROS產生過多，其強氧化性可破壞mtDNA和蛋白質，導致線粒體損傷、壞死，甚至誘發基因突變、細胞因子異常表達、炎癥反應以及免疫系統的異常激活，進一步增加線粒體ROS生成［7］。適時清除衰老或受損的線粒體對細胞具有保護作用。

1.2 線粒體自噬途徑 線粒體自噬的作用(促進或抑制細胞死亡)目前尚不明確。由于去極化，線粒體可通過釋放促凋亡蛋白而激活細胞凋亡通路。有實驗證據表明，重要的自噬基因缺失以及溶酶體功能破壞均可促進細胞發生依賴于胱天蛋白酶(caspase)的凋亡［8－9］。由此可見，若細胞通過自噬清除衰老或功能障礙的線粒體，則線粒體自噬將對細胞起到保護作用。正常細胞清除受損或衰老線粒體的途徑主要包括:①可逆性損傷發生時，有缺陷的線粒體被ATP酶降解為小肽，未折疊的線粒體蛋白通過蛋白酶系統被靶向降解［10］;②喪失功能的線粒體被選擇性地隔離并通過線粒體自噬傳遞至溶酶體降解［11］。

自噬是細胞內的主要降解途徑，可將胞內物質運輸至溶酶體內降解。自噬主要有3種形式:大自噬、小自噬和分子伴侶介導的自噬［12］。大自噬是一種選擇性的大細胞自噬，其特征是形成一個自噬體的雙膜囊泡，最終通過融合將線粒體轉移至核內的溶酶體［13］。小自噬是指線粒體被直接隔離到核內溶酶體中，在無自噬體形成的情況下進行降解［14］。分子伴侶介導的自噬僅發生于哺乳動物細胞內，通過溶酶體途徑選擇性降解胞質中的熱激蛋白70，進而介導線粒體自噬［15］。

1.3 線粒體自噬的信號轉導途徑 線粒體自噬主要包括人第10號染色體缺失的磷酸酶及張力蛋白同源基因誘導的假定激酶1(phosphatase and tensin homologue deleted on chromosome ten induced putative kinase 1，PINK1)－Parkin信號轉導通路和受體介導的線粒體自噬。Parkin是由PARK2基因編碼的一種蛋白，具有E3泛素－蛋白連接酶活性。而Parkin會被PINK1磷酸化，促進Parkin由胞質轉至線粒體，PINK1和Parkin蛋白可降低線粒體膜電位，引起線粒體自噬［16］。Parkin能夠被選擇性地募集到膜電位降低的線粒體，并且介導線粒體被自噬體包裹形成一種雙膜結合的囊泡(自噬體)，而適配器蛋白［如自噬蛋白p62、視神經病變誘導反應蛋白(optineurin，OPTN)、核點蛋白52(nuclear dot protein 52，NDP52)］可識別線粒體蛋白上的磷酸化多聚泛素鏈，并通過與微管相關蛋白1A/1B輕鏈(light chain，LC)3結合形成自噬體［17］。TANK結合激酶1(TANK binding kinase 1，TBK1)可通過磷酸化OPTN形成OPTN－TBK1復合物，從而建立促進線粒體清除的反饋機制［18］。PINK1－Parkin線粒體泛素化途徑還會招募OPTN/NDP52并激活TBK1，促進線粒體自噬，其中還需要OPTN、NDP52和自噬蛋白p62/SQSTM1(sequestosome－1)的參與［19］。

蛋白折疊是維持細胞功能的關鍵，分子伴侶蛋白可介導線粒體維持細胞功能和內穩態平衡［20］。Li等［21］研究發現，線粒體膜外自噬受體蛋白FUN14結構域蛋白1與熱激蛋白70相互作用，通過線粒體外膜轉移酶/線粒體內膜轉移酶復合物介導細胞質蛋白酶體底物的線粒體易位，進入線粒體內被Lon線粒體蛋白同源物1蛋白酶降解;線粒體內未折疊蛋白的過度積累可觸發線粒體相關蛋白聚集體形成，并以FUN14結構域蛋白1依賴性方式自噬降解。

Nix是介導線粒體自噬的重要蛋白，Nix高表達可引起線粒體膜電位變化［22］，從而激活Pink1－Parkin通路誘導線粒體自噬。有研究顯示，Nix可調控Parkin向線粒體募集，激活Parkin－Ubiquitin－p62，介導線粒體自噬［23］。Nix還能招募微管相關蛋白輕鏈識別序列模體自噬相關蛋白(autophagy，Atg)8家族成員LC3A、γ－氨基丁酸受體相關蛋白、γ－氨基丁酸受體相關蛋白L1、γ－氨基丁酸受體相關蛋白L2相互作用，誘導線粒體自噬［24］。同時，Nix還可增加細胞質中游離的Beclin－1水平，其機制是唯BH3域蛋白與Beclin－1競爭Bcl－2或Bcl－xL，從而提高細胞質中Beclin－1水平，而Beclin－1是參與自噬泡生成的重要蛋白，且Bcl－2或Bcl－xL與Beclin－1的結合產物可抑制自噬［25］。另有研究顯示，細胞中缺乏Nix時，細胞內線粒體自噬泡水平并不受影響［26］。因此，線粒體自噬可能還存在其他途徑，未來需深入研究。

2 UC與線粒體自噬

線粒體自噬參與許多自身免疫性疾病的發病，也與炎癥性疾病密切相關。有研究表明，UC患者腸黏膜上皮通透性增加，腸黏膜屏障損傷可能是導致其發病的一個重要因素［27］。腸上皮細胞黏膜屏障功能完整性的維持依賴于能量供應，而線粒體功能可能是保護腸上皮細胞黏膜屏障功能的關鍵［28］。UC的發病受mtDNA和細胞核DNA的雙重調控［29］。線粒體功能障礙導致腸上皮細胞受損(如Paneth細胞、杯狀細胞功能障礙甚至缺失)，進而導致腸上皮細胞屏障功能降低、通透性增加，刺激腸道炎癥發生［30］。

2.1 UC與Atg、ROS的關系 UC發病及其病情程度與多種自噬蛋白、ROS增多相關。線粒體的降解與一系列Atg密切相關，如Atg32［31］、Atg8［32］和Atg11［33］可作用于線粒體表面，并促進線粒體中核心Atg蛋白的組裝，而p62/SQSTM1與吞噬線粒體膜表面Atg8同源蛋白LC3結合誘導形成自噬泡，從而誘導線粒體分解［34］。研究顯示，葡聚糖硫酸鈉(dextran sulphate sodium salt，DSS)可誘導UC小鼠結腸組織中腫瘤壞死因子－α(tumor necrosis factor－α，TNF－α)、白細胞介素(interleukin，IL)－1β表達上調，而LC3B、p62以及Atg7的表達均下調［35］。Atg7、LC3B主要用于檢測自噬活性，p62作為自噬底物，其水平可作為自噬水平的指征。

線粒體是ROS產生的主要場所，在細胞死亡中發揮核心作用。有研究發現，UC患者的血漿、血清，甚至其呼出氣體和唾液中均可檢測到高濃度的氧化分子，且UC的嚴重程度與氧化應激呈正相關［36］。長時間的氧化應激可降低線粒體的生物功能和穩態，促進細胞損傷，并最終導致細胞死亡［30］。線粒體是細胞內ROS產生的主要場所，但不是唯一場所。目前關于激活腸炎的ROS來源仍存在爭議。但有研究顯示，ROS對于腸道可能具有一定的正向作用［37］。

2.2 UC中線粒體自噬與炎癥因子的關系 細胞ROS異常還與某些炎癥因子有關。Dashdorj等［38］研究發現，在DSS誘導的小鼠結腸炎模型中，小鼠結腸和小腸黏膜中的過氧化氫酶、谷胱甘肽過氧化物酶和超氧化物歧化酶水平均顯著低于肝臟組織，而應用線粒體靶向抗氧化物MitQ治療后，線粒體中ROS以及IL－1β、IL－18的表達水平降低。而IL－1β不僅可促進炎癥，還可增加結腸黏膜的通透性［39］。Wang等［40］通過研究猴頭菌多糖對結腸炎大鼠的治療作用發現，猴頭菌多糖可通過抑制腸炎小鼠細胞線粒體ROS水平降低TNF－α、IL－6、IL－8和核因子κB p65的表達，從而減輕炎癥反應;且DSS誘導的大鼠模型線粒體均呈嵴塌陷、膨脹和破碎狀態，其膜電位變化較正常小鼠減少70%。綜上，UC的發生可能與細胞ROS水平異常、線粒體自噬密切相關，但ROS變化與線粒體自噬是否為導致炎癥的關鍵因素目前仍不清楚。

2.3 UC中線粒體自噬與NLRP3炎癥小體的關系UC中線粒體自噬還與炎癥小體相關，UC患者腸道或血清中的NLRP3水平顯著升高［41］。線粒體可以通過激活炎癥小體的分子復合物調節細胞的促炎反應。細胞外ROS、mtDNA、ATP刺激或細胞內(如線粒體損傷)產生的ROS、活性氮均可導致NLRP3與凋亡相關斑點樣蛋白形成復合物，該復合物進一步募集前體caspase－1形成活性NLRP3炎癥小體，刺激caspase－1裂解，釋放活化的IL－1β和IL－18［42］。Banoth和Cassel［43］發現，線粒體還可通過模式識別受體進行信號轉導，誘導腸道炎癥的發生。此外，當線粒體被破壞或突變時，可導致過度的氧化應激抑制ATP的產生，進而導致代謝鏈抑制和mtDNA破壞［44］。

2.4 UC與mtDNA的關系 UC的發生可能與mtDNA突變有關。Boyapati等［45］發現，UC患者結腸黏膜中的線粒體損傷明顯，患者糞便中的mtDNA水平顯著升高;同時，DSS誘導的急性結腸炎小鼠血漿中的mtDNA水平也顯著升高，且與炎癥程度呈正相關;與健康人群相比，UC和CD患者結腸黏膜中的Toll樣受體9以及固有層炎癥細胞顯著升高，可能由于UC中線粒體裂解增加，可在細胞中檢測到更多的mtDNA。mtDNA是Toll樣受體9的激動劑，mtDNA－Toll樣受體9模式在腸道黏膜炎癥發生中具有重要作用。mtDNA突變還可能促進UC患者癌變，但已癌變患者中的mtDNA突變不明顯［37］。然而，Tanaka等［46］發現，UC癌變患者腸黏膜非腫瘤區mtDNA突變顯著。因此，UC的發生可能是由于某些信號分子導致細胞或線粒體內ROS、mtDNA以及其他相關基因突變，擾亂了正常的線粒體代謝途徑和線粒體自噬過程，但確切途徑目前仍不清楚，未來仍需更多的研究證實。

3 CD與線粒體自噬

CD病理可以影響腸道的任何部位，包括回腸末端，病變可累及腸壁深層。CD和UC具有共同的疾病易感性和共同的基因圖譜。潘氏細胞受損和減少是CD腸道病理發生的重要機制。Khaloian等［47］敲除小鼠TNF基因3＇端富含AU的60 bp片段后建立回腸炎小鼠模型，結果發現，小鼠回腸炎癥與潘氏細胞中的溶菌酶和隱窩中的亮氨酸重復序列G蛋白偶聯受體5的減少均呈負相關;而腸道干細胞中熱激蛋白60的缺失可導致線粒體的代謝障礙。Jackson等［48］也發現，線粒體功能障礙可導致潘氏細胞中的線粒體內膜抗增殖蛋白減少，從而增加CD患者的回腸炎癥。

3.1 CD中線粒體自噬與炎癥的關系 CD患者腸道上皮單核吞噬細胞中發生的炎癥刺激源于還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶亞基的突變［49］。Pierre等［50］研究顯示，CD患者回腸及結腸中的線粒體蛋白豐度顯著低于正常人群。CD患者回腸中電信號的高線粒體活性還與CD病程的防御有關［51］。OPTN蛋白是OPTN基因編碼的577aa蛋白，其與CD密切相關［52］。OPTN是線粒體自噬PINK1－Parkin通路的依賴性受體，OPTN基因的啟動子上有核因子κB結合位點，可啟動促炎因子的表達，而受損線粒體被清除會限制炎癥自噬受體p62參與核因子κB表達的過程［53］。但有研究顯示，p62在PINK1－Parkin通路中并不是必需的［10］。

3.2 CD中基因突變與線粒體自噬的關系 IL－10受體α基因、IL－10受體β基因、核苷酸結合寡聚化結構域蛋白2基因、X染色體連鎖凋亡抑制蛋白基因、細胞凋亡抑制蛋白2基因、免疫相關GTP酶家族M蛋白1基因、X盒結合蛋白1等基因突變的機制可能是線粒體自噬的缺失［54－55］。有研究顯示，X染色體連鎖凋亡抑制蛋白基因突變人群易患CD［56］。CD患者的核苷酸結合寡聚化結構域蛋白2基因也通常發生突變［57］。細胞凋亡抑制蛋白2和X染色體連鎖凋亡抑制蛋白均可促進自噬體－溶酶體融合導致線粒體自噬［58］。自噬基因Atg16L1的多態性與CD相關，缺乏Atg16L1的腸黏膜出現潘氏細胞缺失，并表現出TNF介導的細胞壞死，而TNF－α或受體相互作用蛋白激酶抑制劑則可減輕IBD模型的炎癥［59］。Zhang等［60］研究表明，Atg16L1缺乏可導致巨噬細胞功能改變，加重CD病情。Liu等［61］通過敲除DSS誘導的結腸炎小鼠的免疫相關GTP酶家族M蛋白1基因發現，免疫相關GTP酶家族M蛋白1基因可能通過調節腸上皮細胞及潘氏細胞中的線粒體自噬過程調節小鼠腸道的急性炎癥反應。

4 小 結

IBD是由腸上皮細胞能量缺失導致的疾病，與腸上皮細胞的線粒體損傷密切相關。盡管目前尚無證據表明線粒體自噬與IBD存在因果關系，但線粒體自噬與IBD確實存在潛在聯系。多種刺激和環境條件均可擾亂線粒體功能，但IBD腸道線粒體應激的主要刺激因素目前尚未明確。而腸上皮細胞中的線粒體自噬是腸道免疫失常和炎癥過程主要的誘發因素。外來刺激或基因突變等可能是導致線粒體功能障礙、自噬失調的誘發因素，線粒體功能障礙及自噬失衡會影響細胞的正常代謝，導致腸上皮的通透性增加。外來刺激或基因突變與腸道其他因素(如微生物群)相互作用導致腸上皮的通透性增加，共同作用導致IBD發生。目前線粒體自噬在IBD中的作用研究仍處于初級階段，未來仍需深入的研究闡明線粒體自噬在IBD發病中的作用機制。