磷酸鎂骨水泥緩凝改性及其生物醫學應用進展

龔長天，郭衛春

(武漢大學人民醫院骨外科，武漢430060)

創傷、腫瘤等因素導致的大塊骨缺損是困擾骨科醫師的臨床難題，其定義為超過長骨直徑1.5倍的骨缺損［1］。骨移植被認為是大塊骨缺損治療的金標準，然而自體骨移植供區骨量有限，異體骨移植有潛在疾病傳播、經濟負擔較重等問題［2］。近年來人工合成材料常被用于大塊骨缺損的治療。聚甲基丙烯酸甲酯骨水泥因具有較高機械強度、術中易于成型等優點常用于椎體成形術中，但聚甲基丙烯酸甲酯骨水泥自固化過程放出的高熱會引起缺損處二次損傷，而且單體具有細胞毒性、植入部位易形成界面松動，以上缺點限制了其臨床應用［3］。磷酸鈣骨水泥(calcium phosphate bone cement，CPC)的主要成分與天然骨無機相類似，兼具良好的生物相容性、骨傳導性，但CPC機械強度較低，同時不具備骨誘導功能，難以形成缺損處新骨爬行替代［4］。為解決CPC體系中現存的問題，研究者開發了衍生的磷酸鎂骨水泥(magnesium phosphate bone cement，MPC)。MPC在水化反應早期具備高抗壓強度，術中可快速凝固，其主要產物磷酸鎂鹽具有良好的生物相容性，可于內環境中生物降解，另外添加改性物質后的復合MPC能夠滿足多樣化的臨床需求［5］。現就MPC體系改性策略及其在生物醫學領域中的應用進展進行綜述。

1 MPC體系簡介

MPC由固相和液相構成，固相以高溫煅燒氧化鎂、磷酸鹽粉末為主體，液相以純水等固化液為主體，固液兩相在室溫條件下以一定比例均勻混合后可制備MPC，MPC各組分間的性質與配比共同決定了MPC的理化性質及生物學性能［6］。MPC的固化反應是一種快速水化離子反應，為MPC早期提供了早期高抗壓強度，但在反應的同時會釋放大量的熱，不利于MPC的生物醫學應用，因此MPC體系中需要緩凝劑降低峰值溫度、延長放熱時間，為臨床操作提供合適的時間窗［7］。

2 改性緩凝劑種類及其添加策略

2.1 常見改性緩凝劑種類

2.1.1 生物活性物質 生物活性物質是指具備功能性基團的有機物，能在MPC體系中發揮緩凝作用的同時提高生物相容性［8］。生物活性物質常選擇在骨水泥液相中具有一定溶解度的物質，能在水化反應中與氧化鎂發生競爭性溶解，減緩鎂離子(Mg2+)及氫氧根的釋放速率，從而發揮緩凝作用。殼聚糖是甲殼素脫乙酰化的產物，其分子鏈上的氨基及羧基使其具備促成骨細胞分化、增殖的能力。Liao等［9］將一定質量分數殼聚糖加入MPC體系中制備了殼聚糖MPC，結果顯示0.2%～2%添加含量的殼聚糖MPC抗壓強度為45～170 Mpa，凝結時間為12～20 min，抗潰散性較MPC大大提高。其原因可能是主要水化產物磷酸鎂銨晶體包裹在氨基與Mg2+之間形成的橋式聚合物網絡結構中，形成致密結構，最終提高抗壓強度及抗潰散性，但該研究未深入討論殼聚糖MPC的生物學表現。Kim等［10］使用茚二酮(indene，KR34893)與3D打印技術聯合制備了KR－MPC，重點關注了KR－MPC的生物學性能，實時熒光定量聚合酶鏈反應、Western blot等結果顯示人骨髓間充質干細胞和小鼠成骨細胞(MC3T3－E1)中礦物質沉積和成骨細胞標記基因(Runt相關轉錄因子2、堿性磷酸酶、人Ⅰ型膠原蛋白、骨橋蛋白)的體外表達顯著升高。SD大鼠顱骨缺損結果表明，與對照組MPC相比，KR－MPC能更好地促進骨再生。

細胞因子類物質是由細胞分泌的具有特殊生物學功能的小分子蛋白質，近年來也被用于MPC的改性［11］。細胞因子類物質的生物學功能與構象相對應，MPC水化反應產生的高熱對其構象有潛在損傷，因此目前研究常使用細胞因子類物質對預成型后的MPC進行修飾，以獲得具備最佳生物學表現的復合MPC。骨形態發生蛋白是存在于多種細胞生理行為中的功能再生因子，尤其在骨缺損修復中起重要作用［12］。Ding等［13］使用重組人骨形態發生蛋白－2(recombinant human bone morphogenetic protein 2，rhBMP－2)對固化后MPC樣品進行了修飾，與CPC/rhBMP－2相比，MPC/rhBMP－2復合支架的體外成骨分化和磷酸化顯著增強，其生物活性增強的潛在機制是Mg2+通過Smad信號通路促進rhBMP－2的表達水平升高，繼而增強MPC體外成骨誘導分化能力;動物實驗也印證了以上結論，植入8周后的微型CT結果證實CPC/rhBMP－2和MCPC/rhBMP－2均被新生骨組織包裹，且后者周圍形成了更多的新生骨組織。

2.1.2 無機非金屬物質 MPC在研究早期常被用作提高CPC體系機械強度的添加物，近年來才作為骨水泥主體進行大量實驗研究，所以MPC體系常選用CPC進行體系合并，本質上是調整了兩者之間的比例［14］。大多數CPC的凝結時間遠長于MPC，體系合并后的復合MPC峰值溫度下降、放熱反應時間延長，拓展了其生物醫學應用范圍;另外由于兩者的反應機制相近，復合MPC的機械性能獲得較大提升。Yu等［15］向MPC中加入了一定質量分數(0%～65%)的磷酸二氫鈣制備了磷酸鈣鎂骨水泥(calciummagnesium phosphate bone cement，CMPC)，結果表明CMPC凝固時間延長(0%～65%，6～18 min)，抗壓強度呈現先增大后減小的變化趨勢，40%含量組最高可達31.2 Mpa;此外復合CMPC可于三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽緩沖液中體外降解。CMPC浸提液的細胞毒性測試也證明CMPC具有良好的生物相容性。Liu等［16］使用生物活性α－磷酸三鈣(α－tricalcium phosphate，α－TCP)對MPC進行改性，結果表明α－TCP的引入使MPC的早期強度略有降低，7 d后MPC抗壓強度增加;當α－TCP添加含量為8%時，抗壓強度可達68 MPa。體外于純水和模擬體液中浸泡56 d后α－TCP－MPC組的剩余抗壓強度及質量顯著高于MPC組。同時新西蘭白兔股骨髁植入實驗表明α－TCP－MPC組植入部位周圍組織未見炎癥細胞聚集及病理改變，12周后材料組織交界區域有明顯膠原沉積，α－TCP－MPC組周圍部分新生骨已改建為成熟骨組織且新生骨量高于MPC組。可見，α－TCP－MPC不僅可在體內生物降解，還具備良好的骨誘導能力，誘導缺損處新生骨的自身替代。

2.2 改性策略 改性策略的選擇要點主要集中于添加方式與添加含量［17］。MPC體系由固液兩相構成，同種物質可分別由固相液相添加，另外添加含量也影響MPC的整體表現。Yu等［18］和Wang等［19］將磷酸二氫鈣與檸檬酸加入MPC中進行改性，其中檸檬酸從固液兩相分別添加，結果顯示在主要產物相成分未改變的前提下，固相添加使MPC的凝結時間更長、早期抗壓強度更強、孔隙率更高。其原因可能是固相添加時檸檬酸在水化反應過程中存在溶解過程，延后了作用時間，使水化反應更加徹底，主要產物的磷酸鎂鹽含量增加。但兩種添加方式細胞水平生物表現無明顯差異，檸檬酸中包含的功能性基團均使MPC生物相容性提高，說明添加方式主要影響MPC基礎物化性質，尤其是對于生物相容性的影響相對較小，生物相容性的變化主要與物質種類相關。MPC體系的最大改性物質容納量為10%左右，最佳添加含量為5%左右，這為MPC體系中新改性物質初始添加含量的選擇提供了理論依據。Yu等［20］將不同比例的羧甲基殼聚糖(0%～10%)加入MPC中制備了新型可注射復合羧甲基殼聚糖/CMPC，分別對CMPC的物化性質、顯微結構及其表面成骨細胞的黏附、增殖和分化情況進行了評價。結果顯示，與MPC相比，CMPC凝固時間較長，凝固溫度較低;含5%羧甲基殼聚糖的CMPC抗壓強度和抗沖蝕性能最高;成骨細胞在CMPC標本上的黏附、增殖和分化程度均優于MPC，且5%添加含量組綜合性能最佳。曹霄峰等［21］分別使用2%、6%、10%質量分數的膠原肽對MPC進行改性，結果表明MPC水化反應峰值溫度由63℃下降到50℃(10%)，同時放熱峰出現時間延后200 s;適量的膠原肽在不改變MPC體系主要產物物相的前提下，對復合骨水泥具有良好的緩凝作用(8 min)，同時能夠提高復合骨水泥的抗壓強度(6%，39.5 Mpa)，但進一步提高膠原肽的含量會降低復合骨水泥的抗壓強度(10%，28 Mpa)。體外細胞實驗結果表明，膠原肽的加入可促進MC3T3－E1細胞和L929細胞的增殖，且無明顯細胞毒性。

3 MPC的應用進展

3.1 炎癥治療 骨髓炎是青少年骨科常見疾病，也是導致青少年骨缺損的主要原因之一［22］。由于MPC同時具備載抗生素及生物降解能力，能為感染區域局部遞送抗生素的同時減少全身耐藥事件的發生，近年來得到廣泛關注［23］。金黃色葡萄球菌是常見骨髓炎致病菌，特異性針對金黃色葡萄球菌的抗生素骨水泥目前尚不多見［24］。Mestres等［25］通過新西蘭白兔股骨骨髓炎模型系統評價了不同配方抗菌骨水泥治療骨髓炎的效能，共選取了5種骨水泥進行評估:無孔及大孔載多西環素的CPC、以上兩者的非載藥空白對照以及無孔不含多西環素的MPC。金黃色葡萄球菌體外生長實驗結果顯示，大孔載藥CPC組抗菌效果最佳，其原因是大孔隙結構相對表面積最大，利于液體交換及成骨細胞的增殖、血管化，增加了多西環素的局部釋放速率，提高了多西環素的局部濃度。MPC組顯示出了僅次于大孔載藥CPC組的抗菌效果，說明MPC在無孔且不負載多西環素的情況下即可發揮抗菌作用，這可能與MPC主要降解產物呈堿性相關。Cabrejos－Azama等［26］將Mg2+摻雜入鈣磷石中制備復合TCP－MPC，體外探究其對金黃色葡萄球菌感染的治療效果，結果顯示萬古霉素的持續釋放依賴于水泥基質中Mg2+濃度，且26%Mg2+負載TCP－MPC抗菌性能最佳，有助于預防骨再生過程中的感染。

3.2 3D打印 3D打印技術是一項新興的數字化快速成型技術，在計算機輔助下，以物體的幾何參數為基礎，利用相關打印材料，能夠高精度構造復雜結構的物理模型［27］。3D打印技術在個性化治療骨缺損中價值巨大，尤其是不規則骨缺損的重建，近年來受到廣泛關注［28］。具有良好可塑性的生物陶瓷材料是常用的3D打印材料，其主要優點在于成分類似于天然骨無機成分，具有優良的抗壓強度、骨傳導等性能，同時還有良好的生物降解及較強的生物相容性，MPC是其中常見的打印材料之一［29］。Klammert等［30］采用新型兩步法室溫3D打印制備了三維多孔MPC支架，該方法可在制備三維支架的同時負載生物活性物質。與傳統先燒結后修飾工藝相比，該工藝大大提高了緩釋載藥效率及性能。體外細胞實驗結果顯示，MPC支架材料不僅具有良好的三維互聯孔結構、力學性能、可降解性，還具有良好的細胞黏附性能和體外生物相容性，滿足了理想的支架材料用于硬組織再生的條件。鍶離子(Sr2+)可以預防骨質疏松癥并促進骨形成，在骨生物材料領域具有良好的應用前景［31］。Meininger等［32］利用3D打印粉末、高溫燒結和(或)化學轉化等3D打印技術制備了Sr2+取代Mg3(PO4)2的型生物降解MPC。結果表明，新型MPC的平均抗壓強度為36.7 MPa、抗彎強度為24.2 MPa、拉伸強度為10.7 MPa，能夠滿足骨缺損修復材料的基礎參數需求。CT則揭示了復合支架具有高度互聯的多孔結構與正態分布的三維孔隙，其孔隙大小為17.74～26.29μm。此外，體外離子釋放研究結果顯示Mg2+釋放減少，而Sr2+可以緩慢而穩定地從復合支架中連續釋放。Golafshan等［33］則利用Sr2+、聚己內酯(polycaprolactone，PCL)和磷酸鎂陶瓷(magnesium phosphate ceramics，MgP)通過擠壓輔助3D打印法制備了摻鍶復合PCL－MgPSr支架，實驗結果表明含有30%質量分數PCL的MgPSr支架大孔隙率約40%，抗壓強度為4.3 MPa，同時MgPSr－PCL30支架無需補充骨誘導成分即可在體外誘導新骨生成。此外，馬髖臼大塊骨缺損模型的微型CT及組織學分析結果表明MgPSr－PCL30支架可在體內穩定降解6個月，同時可誘導骨再生填補缺損處。

3.3 仿生成孔 天然骨組織具備3D多孔結構，利于局部物質交換及新陳代謝［34］。研究者在MPC的開發中也借鑒了此類3D結構的優點。目前最常使用的方法是向骨水泥配方中加入具備一定粒徑的可溶性惰性成孔劑，利用成孔劑與MPC之間的溶解度差異制造孔隙結構。可溶性惰性成孔劑的優點在于成本較低且孔隙大小易于控制，但在孔隙比例和孔隙分布上具有一定的隨機性，過多的孔隙及其在骨水泥內部的非均勻排列會導致機械強度的過度損失，尋找合適的平衡點仍是一個難題。Wei等［35］將不同粒徑氯化鈉晶體作為成孔劑分別制備了微孔及大孔MPC，以探究孔隙大小對MPC機械強度和生物學性能的影響，結果顯示大孔MPC組的體外降解速率高于微孔組，MG63細胞的黏附、增殖、分化率及堿性磷酸酶活性均高于微孔組，同時兔股骨髁缺損模型也驗證了以上結論，大孔MPC組植入3個月后的缺損區域新生骨面積顯著增加。提高生物相容性的代價是大孔MPC組的機械強度損失，平均抗壓強度僅為8.62 Mpa，遠低于皮質骨的抗壓強度，難以滿足臨床需求。

3.4 新型可吸收椎間融合器 脊柱退行性病變保守治療效果不佳后常選擇脊柱融合作為治療方法。近年來椎間融合器在脊柱外科中廣泛使用，椎間融合器不僅可以提高融合椎體間的穩定性，還可以在限制移植骨活動范圍的同時恢復椎間隙高度和體積，降低椎間盤內壓力、減少疼痛事件的發生［36］。為解決當前椎間融合器存在的應力遮擋、不可吸收等問題，韓振川等［37］設計了一種MPC椎間融合器，并將已廣泛應用于臨床的聚醚醚酮椎間融合器作為對照組，結果表明MPC椎間融合器在承受相同外力時抵抗形變的能力明顯強于聚醚醚酮椎間融合器，這是由MPC椎間融合器與周圍組織化學鍵結合所致，MPC椎間融合器可兼具高機械強度和高體積穩定性。MPC椎間融合器具備治療骨退行性病變的應用前景，但是當前缺少相關體內實驗數據支撐，有待進一步研究。

4 小 結

MPC是一種基于微溶鹽水化反應生成的無機非金屬生物陶瓷材料，具有早期高強度、快速固化等特點，同時具有良好的生物相容性及生物降解性，因此近年來得到骨組織工程學研究者的重視。大量實驗研究證明，MPC在具有滿足骨組織工程基礎機械性能的同時無細胞毒性及遺傳毒性，另外在動物實驗中也證明了MPC具有骨整合、骨傳導、骨誘導性能，可通過相關信號通路促進間充質干細胞/成骨細胞的增殖、分化與黏附，最終在骨缺損處通過生物降解誘導形成新骨替代。另外不同種類的改性物質可加入MPC體系中，提高其物化性質和生物相容性。此外，MPC在3D打印、載藥等方面也被成功應用。但MPC相關研究也存在不足之處，如不同研究間的基礎配方差異較大，使用的細胞系及動物模型不同，結果不具備橫向可比性，無法大規模量化評價MPC體系的整體性能。同時MPC研究水平尚不深入，分子機制水平的研究較少。