原發(fā)性膽汁性膽管炎小鼠模型及其應(yīng)用研究進展

2021-12-01 01:30:04王資隆靳睿封波

醫(yī)學(xué)綜述 2021年11期

關(guān)鍵詞：小鼠模型

王資隆，靳睿，封波

(北京大學(xué)人民醫(yī)院北京大學(xué)肝病研究所丙型肝炎和肝病免疫治療北京市重點實驗室，北京100044)

原發(fā)性膽汁性膽管炎(primary biliary cholangitis，PBC)是一種由自身免疫介導(dǎo)、肝內(nèi)膽管上皮細胞破壞導(dǎo)致的慢性膽汁淤積性肝病，以中年女性多見，臨床癥狀主要為疲乏無力和瘙癢;病理表現(xiàn)為肝匯管區(qū)淋巴細胞浸潤，選擇性侵犯膽小管上皮細胞，造成肝內(nèi)膽汁淤積，最終發(fā)展為肝衰竭;血清與免疫學(xué)指標為出現(xiàn)特征性的自身抗體［主要為抗線粒體抗體(antimitochondrial antibody，AMA)］、免疫球蛋白(immunoglobulin，Ig)M與堿性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALP)水平升高［1］。其發(fā)病可能與遺傳、環(huán)境、免疫、藥物等因素有關(guān)，但具體病因與發(fā)病機制尚不明確。目前臨床治療中，尚有部分患者對熊去氧膽酸應(yīng)答不佳，因此制備動物模型分析PBC病因、研究發(fā)病機制以及藥物篩選、預(yù)后具有重要價值。在動物模型中，倉鼠的膽汁酸合成和代謝與人類最為相似，但研究者普遍以小鼠為主要模型，是因其具有體積小、孕期短和壽命長可滿足實驗周期需要等優(yōu)點，此外還培育了背景明確的不同品系轉(zhuǎn)基因小鼠，這對進一步探索疾病機制也有重要意義［2］。當前已構(gòu)建多種具有人類PBC患者特征的小鼠模型，現(xiàn)就化學(xué)、生物誘導(dǎo)和基因修飾類PBC小鼠模型及其應(yīng)用進展予以綜述。

1 化學(xué)誘導(dǎo)類小鼠模型

1.1 2－辛炔酸誘導(dǎo)模型 2－辛炔酸是人工合成的物質(zhì)，化妝品和口香糖中均有存在，具有被AMA陽性的PBC血清所識別的異源修飾表位。Wakabayashi等［3］將2－辛炔酸與牛血清白蛋白耦合免疫C57BL/6小鼠發(fā)現(xiàn)，其表現(xiàn)出類似PBC患者的特征。2－辛炔酸誘導(dǎo)小鼠可產(chǎn)生AMA，血清中的腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor，TNF)－α和γ干擾素(interferon，IFN)水平顯著升高;病理可觀察到匯管區(qū)大量以CD8+T為主的淋巴細胞浸潤，以及膽管缺失、上皮肉芽腫等。

2－辛炔酸誘導(dǎo)小鼠模型構(gòu)建簡單，因此在機制研究及藥物研發(fā)等方面應(yīng)用廣泛。研究者利用該小鼠模型對肝臟纖維化進行了不同探索，如Hsueh等［4］發(fā)現(xiàn)，外源性白細胞介素(interleukin，IL)－10可增加肝臟炎癥與纖維化，這可能與其招募和激活CD4+T、CD8+T、自然殺傷和自然殺傷T細胞并增加膽管損傷有關(guān);Hintermann等［5］發(fā)現(xiàn)，緊密連接黏附分子B和C在小鼠肝血管系統(tǒng)中上調(diào)，提示肝臟纖維化與其有關(guān)。也有研究者將人臍帶源性間充質(zhì)干細胞與2－辛炔酸－牛血清蛋白共同注射，結(jié)果顯示其減弱了PBC的誘導(dǎo)過程［6］，這為臨床治療提供了新思路。

2－辛炔酸誘導(dǎo)小鼠在免疫學(xué)、血清學(xué)和病理上與人類疾病非常相似，尤其是淋巴細胞浸潤類型。此外，還出現(xiàn)了特征性的單核細胞浸潤與上皮肉芽腫。但該小鼠模型沒有性別差異，且在肝臟病理中未觀察到任何脂肪變性、嗜酸粒細胞增多癥或膽汁淤積癥的證據(jù)，也未觀察到肝臟纖維化。

1.2 聚肌胞苷酸誘導(dǎo)模型研究發(fā)現(xiàn)使用Ⅰ型IFN治療的過程中，PBC癥狀會加重［7］。而聚肌胞苷酸可以誘導(dǎo)產(chǎn)生Ⅰ型IFN，并影響自身免疫。因此研究者嘗試向小鼠注射聚肌胞苷酸，結(jié)果顯示其表現(xiàn)出類似PBC的特征［8］。在24周時，大部分小鼠可檢測到AMA，血清中細胞因子IL－12p70、IL－10、單核細胞趨化蛋白、IFN－γ和IL－6、丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶和天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶水平升高;肝組織病理可觀察到淋巴細胞浸潤，CD8+T細胞主要集中在膽管附近。此外，該模型還出現(xiàn)了肝外器官的自身免疫病變，如腮腺炎、胰腺炎和間質(zhì)性腎炎［8］。

聚肌胞苷酸誘導(dǎo)模型操作簡單，且能出現(xiàn)肝臟以外自身免疫表現(xiàn)，故可用于分析PBC早期肝組織淋巴細胞浸潤情況，也可用于新型藥物的研發(fā)和治療方案的篩選。Li等［9］發(fā)現(xiàn)，沉默信息調(diào)節(jié)因子1激活劑白藜蘆醇可顯著改善肝損傷與降低轉(zhuǎn)氨酶水平，提示激活沉默信息調(diào)節(jié)因子1信號通路可能是PBC治療的新靶點。但該模型無明確的雌性優(yōu)勢，肝臟病理與人類PBC也有較大區(qū)別，并沒有出現(xiàn)肉芽腫和嗜酸粒細胞。

2 生物誘導(dǎo)類小鼠模型

2.1 新鞘脂菌誘導(dǎo)模型新鞘脂菌是一種可以代謝血紅蛋白和雌性激素的細菌，被認為是PBC的重要致病因素，其兩種蛋白質(zhì)氨基酸序列與人抗丙酮酸脫氫酶復(fù)合體E2亞基(pyruvate dehydrogenase complex E2，PDC－E2)的主要免疫原性脂化結(jié)構(gòu)呈高度同源性［10］。

有研究者將新鞘脂菌5×107CFU(菌落形成單位)靜脈注射到C57BL/6、NOD和SJL系小鼠體內(nèi)發(fā)現(xiàn)，其均表現(xiàn)出類似PBC的慢性病變［11］。新鞘脂菌誘導(dǎo)的小鼠模型產(chǎn)生了針對PDC－E2的IgG和IgA抗體;病理顯示門靜脈炎癥伴大量淋巴細胞浸潤、膽管損傷和膽囊破壞以及肉芽腫形成［11］。Arsenijevic等［12］發(fā)現(xiàn)，半乳凝素－3缺失和半乳凝素－3抑制劑均可減輕新鞘脂菌誘導(dǎo)模型的膽管損傷，提示抑制半乳凝素－3可能是PBC的潛在治療策略。

新鞘脂菌誘導(dǎo)模型造模時間短，出現(xiàn)特異性的抗體，且病理表現(xiàn)與人類極為相似，但同樣無雌性優(yōu)勢，也未出現(xiàn)肝纖維化表現(xiàn)。

2.2 大腸埃希菌誘導(dǎo)模型 PBC發(fā)病可能與病原微生物感染有關(guān)，病原微生物通過分子模擬自身抗原來誘發(fā)自身免疫反應(yīng)。人PDC－E2與大腸埃希菌PDC－E2具有交叉識別機制［13］，高度相似的非PDC－E2微生物序列存在于大腸埃希菌等細菌內(nèi)。

研究者給NOD.B6 Idd10/Idd18小鼠靜脈注射大腸埃希菌，小鼠出現(xiàn)了AMA和膽管損傷，肝臟病變與人類PBC門靜脈浸潤十分相似，血清中檢測到PDC－E2和2－酮戊二酸脫氫酶復(fù)合體E2亞基抗體，其中PDC－E2抗體在感染4周后達到高峰［14］。但該模型注射大腸埃希菌19周后并未出現(xiàn)顯著的肝臟病理改變，直到26周才觀察到明顯的門靜脈炎癥并伴有肉芽腫形成，不同程度的膽管細胞損傷，部分膽管有輕微的淋巴樣細胞浸潤，而部分膽管上皮細胞完全消失。

大腸埃希菌誘導(dǎo)模型常用于發(fā)病危險因素的研究，除家族遺傳等因素外，尿路感染也是其發(fā)病因素［10］。通過大腸埃希菌尿路感染誘導(dǎo)的小鼠模型發(fā)現(xiàn)，其組織學(xué)和免疫學(xué)特征與PBC患者相似，包括膽管破壞、肉芽腫形成和淋巴細胞浸潤［15］。

3 基因修飾類小鼠模型

3.1 NOD.c3c4小鼠模型 NOD小鼠模型是一種成熟的自身免疫1型糖尿病動物模型，NOD.c3c4來源于NOD小鼠，具有異常的細胞增殖和無細胞凋亡特性，有助于膽管囊腫的形成，這一缺陷加速了小鼠的自身免疫反應(yīng)［16］，模擬了PBC患者的某些特征。NOD.c3c4小鼠體內(nèi)可出現(xiàn)AMA、抗核抗體和抗－Sm抗體，血清中丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶和天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶水平均升高。病理可觀察到早期囊腫形成和淋巴細胞浸潤，主要為CD3+、CD4+和CD8+淋巴細胞。部分小鼠還可觀察到嗜酸粒細胞浸潤和類似肉芽腫病變。此外，小鼠的膽管疾病可引起肝大甚至肝衰竭，若膽管阻塞還可導(dǎo)致腹水的形成［17］。

Schrumpf等［18］利用此模型衍生了GF(germ free)NOD.c3c4模型，發(fā)現(xiàn)膽管反應(yīng)較輕，提示腸道微生物參與了疾病的發(fā)生，但腸道微生物對于疾病的作用仍需進一步探索。Mason［19］發(fā)現(xiàn)，抗反轉(zhuǎn)錄病毒可顯著改善NOD.c3c4小鼠的膽管炎，提示β反轉(zhuǎn)錄病毒與膽管炎的發(fā)展及線粒體抗體的產(chǎn)生有密切聯(lián)系。

NOD.c3c4小鼠模型在免疫學(xué)、血清學(xué)和病理等方面與PBC患者表現(xiàn)有類似之處，適合基因調(diào)控等方面的進一步研究。但與人類疾病仍有較大差別，其雌性優(yōu)勢并不十分明顯，AMA產(chǎn)生率僅為60%左右，小鼠的病理主要為肝內(nèi)多囊性病變［17］。

3.2 轉(zhuǎn)化生長因子－β(transforming growth factor－β，TGF－β)Ⅱ型受體顯性失活型小鼠模型 TGF－β對免疫穩(wěn)態(tài)和耐受起著關(guān)鍵作用，異常的TGF－β信號分子可導(dǎo)致肝臟自身抗原的耐受性喪失，促進自身免疫疾病的發(fā)生。在CD4啟動子的控制和缺乏CD8沉默子的條件下，TGF－βⅡ型受體顯性失活型小鼠可自發(fā)形成類似人類PBC的特征［20］，表明TGF－β參與了PBC的發(fā)病機制。

TGF－βⅡ型受體顯性失活型小鼠在22～24周時自發(fā)產(chǎn)生AMA，且主要為IgA水平升高，IgM水平并沒有明顯升高。同時，小鼠血清IFN－α、TNF－β、IL－6和IL－12p40等細胞因子水平顯著升高。病理方面可觀察到匯管區(qū)出現(xiàn)中到重度淋巴細胞浸潤，以及特征性的單核/巨噬細胞浸潤。與PBC患者類似，TGF－βⅡ型受體顯性失活型小鼠也發(fā)現(xiàn)CD8細胞總數(shù)和百分數(shù)均升高，CD4+/CD8+T細胞比值下降，并觀察到膽管損傷［21］。

研究者在該模型背景下通過基因敲除構(gòu)建了新的小鼠模型，對研究趨化因子和免疫分子在發(fā)病中的機制，臨床藥物的優(yōu)化發(fā)揮重要作用。Ma等［22］在該小鼠模型基礎(chǔ)上敲除CXC趨化因子受體3，發(fā)現(xiàn)其促進小鼠CD8+細胞的活化，導(dǎo)致自身免疫性膽管炎的加重;Tsuda等［23］在該模型基礎(chǔ)上建立了IL－12p35－/－和IL－12p40－/－小鼠模型，結(jié)果發(fā)現(xiàn)其肝臟炎癥嚴重程度與原模型相似但卻延遲發(fā)生;Moritok等［24］探索了新的人源化抗CD20 IgG1抗體對該模型的治療作用，發(fā)現(xiàn)其較抗人CD20的嵌合抗體改善效果更為明顯，提示藥物療效不佳的原因可能為體內(nèi)存在抗藥物抗體，從而為臨床藥物的優(yōu)化提供新思路。

TGF－βⅡ型受體顯性失活型小鼠模型自發(fā)產(chǎn)生AMA且陽性率高，與PBC患者有相似的血清學(xué)特征，匯管區(qū)有淋巴細胞和單核細胞浸潤，膽管上皮破壞嚴重，可以很好地模擬人類疾病。但存在無雌性優(yōu)勢，門靜脈區(qū)嗜酸粒細胞浸潤和肉芽腫形成并不明顯，IgA水平升高等與人類疾病不同之處。

3.3 人IL－2受體α敲除(interleukin－2 receptorα－/－，IL－2Rα－/－)小鼠模型人IL－2Rα－/－小鼠模型血清學(xué)AMA陽性，IgG、IgA顯著增加，血清輔助性T細胞(helper T cell，Th)1細胞因子(TNF－α、IL－2、IL－12p40、IFN－γ)和Th2細胞因子(IL－6)水平顯著升高。病理肝臟匯管區(qū)有淋巴細胞和單核細胞中度浸潤，小葉間膽管細胞核不規(guī)則排列，扭曲的管腔和細胞脫離基膜，與PBC患者慢性非化膿性破壞性膽管炎表現(xiàn)相似。門靜脈浸潤大量的CD8+和CD4+細胞，且以CD8+細胞為主［25］。

近年來，IL－12被認為與PBC有密切聯(lián)系，如Yao等［26］構(gòu)建的IL－12p40－/－IL－2Rα－/－小鼠模型表現(xiàn)出更嚴重的門靜脈炎癥和膽管損傷。為探索不同T細胞在PBC發(fā)病機制中的作用，Hsu等［27］構(gòu)建了IL－2Rα－/－CD4－/－和IL－2Rα－/－CD8－/－模型，結(jié)果發(fā)現(xiàn)前者膽管損傷加重，結(jié)腸炎癥減輕，而后者相反，提示CD8+T細胞介導(dǎo)膽管損傷，CD4+T細胞介導(dǎo)結(jié)腸特異性免疫反應(yīng)。

IL－2Rα－/－小鼠模型可以很好地模擬早期PBC的肝匯管區(qū)炎癥與膽小管破壞，產(chǎn)生的AMA可結(jié)合到自身抗原的內(nèi)部硫辛酸結(jié)構(gòu)域。但該模型年齡與性別無差異，也沒有肉芽腫和嗜酸粒細胞浸潤;此外還會合并其他自身免疫性疾?。?5］，如溶血性貧血、急性結(jié)腸炎等，導(dǎo)致過早死亡，因此該模型并不是PBC的特異性模型。

3.4 Scurfy小鼠模型調(diào)節(jié)性T細胞(regulatory T cell，Treg細胞)在自身免疫病中發(fā)揮抑制疾病的作用，而叉頭框蛋白3對Treg細胞的生長、穩(wěn)定和功能非常重要。Scurfy小鼠是通過叉頭框蛋白p3基因突變，導(dǎo)致Treg細胞功能缺失而建立的小鼠模型［28］。

Scurfy小鼠模型可產(chǎn)生AMA，IgM、IgA及IFN－γ、IL－6、IL－12p40、IL－18和IL－10等細胞因子水平升高。病理出現(xiàn)PBC樣門靜脈炎癥和膽管損傷，小葉間膽管淋巴細胞浸潤和退行性病變，肝臟病理中可觀察到中性粒細胞、嗜酸粒細胞和組織細胞浸潤［28］。

Scurfy小鼠模型在血清學(xué)和病理上與PBC十分相似，對于進一步研究Treg細胞在疾病機制中的作用有重要意義。但該模型與人類疾病仍有許多不同之處［28］，如沒有產(chǎn)生肉芽腫，小鼠壽命極短，只有4周左右［29］，且雄性失去生育能力等。

3.5 陰離子交換蛋白2(anion exchanger 2，AE2)a，b－/－小鼠模型 AE2參與細胞內(nèi)pH調(diào)節(jié)和經(jīng)上皮酸堿轉(zhuǎn)運，刺激膽汁性碳酸氫鹽排泄，AE2損傷可致膽管上皮細胞損傷與對膽管炎誘導(dǎo)的凋亡敏感［30］，也可誘導(dǎo)自噬失調(diào)［31］使模型出現(xiàn)類似PBC的特征。

AE2a，b－/－小鼠模型大多產(chǎn)生了針對PDC－E2的AMA，血清丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶和天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶，以及IFN－γ和IL－12p70等細胞因子水平升高。該模型出現(xiàn)了膽汁淤積性肝損傷的表現(xiàn)，約90%出現(xiàn)了門靜脈炎癥，同時還出現(xiàn)輕微的纖維化和炎癥浸潤，浸潤細胞主要為單核細胞。損傷的膽管周圍出現(xiàn)CD4+T和CD8+T細胞，且以CD8+T細胞為主［29］。

AE2 a，b－/－小鼠模型在免疫和形態(tài)學(xué)上與PBC患者類似，均有AMA產(chǎn)生和一些細胞因子水平的升高，還出現(xiàn)了CD8+T細胞的增多和Treg細胞的減少，門靜脈區(qū)炎癥細胞浸潤。但該模型同時也存在無雌性優(yōu)勢、實驗環(huán)境和實驗成本較高，且存在合并其他疾病和難以繁衍的問題［29］。

3.6 腺嘌呤尿嘧啶富含元件敲除(adenylate uridylaterich element del，ARE_Del－/－)小鼠模型 ARE_Del－/－小鼠模型是通過敲除IFN－γ基因3＇非翻譯區(qū)中具有162 nt的ARE而建立［32］。敲除ARE后導(dǎo)致IFN－γ的長期慢性表達，而IFN－γ可能在PBC啟動階段對膽管上皮細胞發(fā)揮致病作用。

ARE_Del－/－小鼠模型在8～10周時，即可檢測到AMA，血清丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶和天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶明顯升高，總膽汁酸升高;20周時，出現(xiàn)中到重度門靜脈淋巴浸潤，門靜脈和小葉炎癥，小膽管損傷和肉芽腫形成。小鼠膽管破壞與年齡有關(guān)，肝臟呈現(xiàn)輕度纖維化［33］。作為少有的具有雌性優(yōu)勢的小鼠模型，推測與IFN信號有關(guān)。Bae等［33］發(fā)現(xiàn)，雌性小鼠Th1細胞介導(dǎo)的信號通路高度上調(diào)，提示可能與IFN－γ通過CD4+T細胞激活的Th1細胞反應(yīng)有關(guān)。隨后他們將該模型與IFNⅠ型受體α鏈基因敲除小鼠雜交發(fā)現(xiàn)，ARE_Del－/－IFNⅠ型受體α鏈基因敲除小鼠的性別優(yōu)勢消失，進一步證明了IFN信號與PBC雌性優(yōu)勢相關(guān)［34］。

ARE_Del－/－小鼠模型體內(nèi)出現(xiàn)針對PDC－E2等的自身抗體，膽管破壞與年齡有關(guān)，有明顯的雌性優(yōu)勢。但門靜脈炎癥和肝實質(zhì)炎癥主要由CD4+T細胞引起，與PBC患者的CD8+T細胞浸潤不同。此外，還存在肝纖維化程度較低、模型特異度不高等問題［34］。

4 聯(lián)合構(gòu)建小鼠模型

針對化學(xué)誘導(dǎo)小鼠模型存在誘導(dǎo)時間過長與病理表現(xiàn)較輕的不足，Ambrosini等［35］將2－辛炔酸與聚肌胞苷酸兩種藥物進行聯(lián)合免疫實驗，發(fā)現(xiàn)與2－辛炔酸單獨免疫組相比，聯(lián)合免疫組血漿中的AMA水平并未增加，但血漿中的IFN－γ、TNF－α、IL－12p40和IL－6等細胞因子水平顯著升高;同時，聯(lián)合免疫小鼠肝臟中CD8+T細胞浸潤顯著增加。聯(lián)合免疫1周后，自然殺傷細胞的活性顯著增強。與單獨免疫小鼠相比，聯(lián)合免疫小鼠的表現(xiàn)更接近PBC患者，這可能由于聯(lián)合免疫小鼠在自身免疫耐受喪失的基礎(chǔ)上進行了二次打擊，更真實地模仿了人類疾病［35］。此外，除了不同化學(xué)誘導(dǎo)之間的聯(lián)合免疫，也有學(xué)者嘗試使用化學(xué)與生物誘導(dǎo)聯(lián)合免疫，但與單獨誘導(dǎo)小鼠相比，大腸埃希菌與聚肌胞苷酸聯(lián)合誘導(dǎo)小鼠在生物化學(xué)、組織學(xué)等方面并無明顯差異［36］。

5 小結(jié)