微環境調控在糖尿病腎病腎小管間質纖維化過程中的作用

羅瑩瑩，王小琴，鄧丹芳，孫龍，林臘梅

(1.湖北中醫藥大學中醫臨床學院，武漢430061;2.湖北省中醫院 湖北省中醫藥研究院 湖北中醫藥大學附屬醫院腎病科，武漢430074)

糖尿病腎病(diabetic nephropathy，DN)是糖尿病的慢性并發癥，2017年全球DN造成的傷殘調整壽命年損失為1 100萬人年，是慢性腎病傷殘調整壽命年損失的首要原因［1］。DN也是發達國家終末期腎病和我國慢性腎病的主要病因，占我國慢性腎病發病原因的26.96%［2］。

既往一般認為DN是一種腎小球疾病，但隨著研究的深入認為，與腎小球損傷相比，腎小管病變和腎間質纖維化可作為相對獨立的發病機制用來預測腎臟疾病進展。腎小管間質纖維化(tubulointerstitial fibrosis，TIF)是DN的重要特征，輕度的TIF足以增加腎小球損傷的易感性，形成腎小管損傷——腎小球損傷的惡性循環［3］。TIF主要以間質膠原沉積、炎癥細胞浸潤、腎小管細胞損傷丟失、成纖維細胞積聚和管周微血管稀疏為特征［4］。研究TIF相關調控機制，及時有效地干預致病靶點，對治療DN至關重要。TIF通常呈局灶性階段性分布，提示局部組織微環境可能在TIF發生發展過程中發揮重要作用［5－6］。但目前TIF的具體發生、發展機制仍不清楚。為更好地探究微環境影響DN TIF發生、發展的可能作用機制，現就DN中局部炎癥、代謝紊亂、腎臟微血管等腎小管周圍微環境及上皮－間充質轉化(epithelial mesenchymal transition，EMT)對DN TIF進程的影響進行綜述，為DN的預防與治療提供新思路。

1 腎臟損傷與促纖維化微環境的形成

1.1 TIF誘導期炎癥微環境的形成 長期高血糖狀態誘導間質損傷和炎癥細胞浸潤，在損傷組織自我修復過程中，免疫細胞能夠合成多種促纖維化的細胞因子，免疫炎癥微環境持續存在使得這種修復過程成為進行性腎間質纖維化的中心驅動因素［7］。糖尿病狀態下腎小管間質炎癥細胞浸潤，激活的巨噬細胞與樹突狀細胞、T淋巴細胞及活化的腎臟固有細胞共同參與調節適應性免疫，持續的細胞因子壓力和多余炎癥細胞的積聚是促進DN腎小管間質損傷和TIF的主要效應器［8－10］。

DN中巨噬細胞浸潤促進TIF的進展［11］。在損傷的初始階段，主要由γ干擾素和脂多糖誘導M1型巨噬細胞浸潤，進而參與組織炎癥反應;當損傷持續存在時，不斷聚集的脂多糖可通過激活核因子κB，促進其下游一系列炎癥介質釋放，過度釋放的炎癥因子進一步激活核因子κB形成正反饋環放大效應，引發腎臟組織損傷的“瀑布效應”。隨著疾病的進展，巨噬細胞在白細胞介素－4和白細胞介素－13的誘導下轉變為M2表型，分泌白細胞介素－10等抗炎介質，抑制腎臟炎癥反應進入組織修復階段［12－13］。M2型巨噬細胞合成并釋放轉化生長因子－β(transforming growth factor－β，TGF－β)、成纖維細胞生長因子和表皮生長因子受體等影響纖維形成的產物，形成局部纖維化微環境，抑制腎小管上皮細胞(tubular epithelial cell，TEC)和間質微血管內皮細胞的生長，刺激淋巴細胞趨化并誘導成纖維細胞的募集和增殖［14－16］。骨髓來源的巨噬細胞為肌成纖維細胞(myofibroblast，MyoF)的前體細胞之一，在腎臟損傷局部微環境中經歷巨噬細胞－MyoF轉化，可直接參與腎小管間質細胞外基質(extracellular matrix，ECM)的合成［17］。此外，TEC損傷后修復性M2型巨噬細胞浸潤產生的基質金屬蛋白酶9可使腎臟基底膜屏障降解，并通過Wnt/β聯蛋白途徑參與TEC的EMT過程。有研究發現，抑制M2型巨噬細胞浸潤可減少間質成纖維細胞的活化及ECM的沉積［18－19］。

樹突狀細胞廣泛存在于腎小管間質中，可通過激活抗原特異性T淋巴細胞觸發適應性免疫應答，從而啟動DN中的組織損傷和修復。研究發現，阿托伐他汀可通過抑制P－選擇素的表達和樹突狀細胞遷移抑制腎小管間質損傷［20］;而抑制CD103+樹突狀細胞介導的CD8+T細胞反應可減輕DN大鼠腎功能損傷及纖維化［21］。大量研究顯示，發生炎癥和纖維化的腎臟組織均有明顯的T淋巴細胞浸潤，T細胞激活后產生趨化因子和細胞因子，誘導單核細胞募集從而增強炎癥反應;此外，T細胞產生的TGF－β1在慢性腎功能不全時可通過EMT途徑調節成纖維細胞的分化，進而促進MyoF積累，影響TIF進展［22－25］。Tapmeier等［26］研究發現，耗竭單側輸尿管梗阻小鼠模型CD4+T細胞或淋巴細胞缺陷RAG－/－小鼠的腎臟纖維化程度減輕;用CD4+T細胞重建RAG－/－小鼠可恢復單側輸尿管梗阻模型誘導的腎纖維化嚴重程度，表明CD4+T細胞在腎纖維化中起關鍵作用。

由此可見，DN作為一種微血管病變，在病變早期即出現以炎癥細胞浸潤和纖維化為特征的腎小管間質病變，這種變化導致腎小球高壓及濾過率的降低。M2型巨噬細胞被認為具有“腫瘤相關巨噬細胞”的功能，在一定程度上影響組織從炎癥修復向“炎－癌”的轉化。探索實現巨噬細胞M2到M1型轉化的機制和藥物，將有助于早期控制纖維化腎病。

1.2 代謝微環境與腎小管間質損傷 腎臟的代謝活動需要高氧的支持，一氧化氮(nitric oxide，NO)通過舒張血管增加腎血流量和氧氣釋放，是腎臟微血管內氧供應和消耗的主要調節因子［27］。DN中NO代謝紊亂，除1型DN早期NO合成升高外，DN中NO的代謝通常受損。高血糖本身和(或)晚期糖基化終末產物都可通過抑制腎內皮一氧化氮合酶減少NO的產生［28－29］。微血管系統損傷、氧彌散降低以及腎臟細胞代謝異常等造成缺氧狀態，缺氧繼而可對TEC、間質炎癥細胞、內皮細胞等細胞的代謝產生深遠影響［27］。缺氧誘導因子(hypoxia－inducible factor，HIF)是調控氧穩態的關鍵轉錄因子，在缺氧條件下，HIF－α無法被降解而與HIF－β結合為穩定的二聚體，隨后進入細胞核中并誘導下游血管內皮生長因子、金屬蛋白酶組織抑制物、結締組織生長因子等一系列靶基因的轉錄，從而對血管生成、細胞增殖和腎間質過量ECM的沉積產生重要影響［30］。糖尿病低氧環境下，HIF－1α的高表達可致p53上調，導致TEC在G2/M期停滯，并激活TGF－β和結締組織生長因子介導的纖維化信號通路，導致ECM生成和TIF的發生［31］。在慢性腎病小鼠模型中，缺氧可上調與腎小管細胞HIF－1α激活相關的血管內皮生長因子、纖維連接蛋白和1型膠原蛋白的表達，明顯加重腎纖維化［32］。

研究表明，抑制高糖/缺氧誘導的HIF－1α積累，可有效阻斷TEC的EMT過程，從而減輕DN小鼠的TIF進展［33］。高糖可以誘導活性氧類的產生，使腎小管細胞出現氧化應激特征。在慢性高血糖環境中，TEC合成活性氧類產物和趨化因子等炎癥介質，經自分泌或旁分泌途徑透過緊密連接屏障進入腎間質，造成細胞DNA損傷、脂質過氧化等參與腎間質損傷［34－35］。有研究發現，DN小鼠的腎小管中積累了過量的晚期氧化蛋白產物，可引起腎小管的線粒體功能障礙和氧化應激，并通過蛋白激酶C信號通路和CD36受體途徑加重早期DN的TIF［36－37］。通過減少氧化物生成和蛋白質氧化，改變受損腎小管細胞的氧化還原能力，減少活性氧類的產生來源，可有效改善DN模型氧化應激所致的腎小管間質損傷和TIF［38］。

脂肪酸氧化是近端小管細胞代謝的首選能源。腎小管細胞線粒體的氧化損傷和功能障礙可導致DN腎臟循環中脂肪酸的攝入與消耗失衡。糖尿病模型小鼠腎TEC內的脂質積聚具有細胞毒性，是導致腎小管萎縮的發病機制之一。有研究表明，過氧化物酶體增殖物激活受體是調節脂肪酸攝取和氧化的關鍵轉錄因子，過氧化物酶體增殖物激活受體γ途徑異常可引起腎小管細胞脂質代謝紊亂，導致腎小管擴張、TIF和腎功能受損［39］。在DN中，炎癥和纖維化信號通路被激活，腎小管補體C5a水平升高，C5a/C5aR信號通路激活影響腎小管細胞脂質代謝，并通過磷脂酰肌醇－3－激酶/蛋白激酶B通路驅動腎小管細胞TGF－β的分泌;經C5a抑制劑治療糖尿病小鼠腎臟中脂質積聚減少，腎小管間質損傷和纖維化亦有所減輕［8］。

DN的核心是代謝紊亂，糖代謝異常影響氧和脂質等其他代謝的調控，局部代謝環境的失調引發糖尿病腎臟微炎癥，并誘導腎小管間質損傷和纖維化發生。

1.3 腎小管周圍血管微環境改變 腎臟微血管功能障礙既是糖尿病間質缺氧損傷的結果，又是創造缺氧微環境、加速TIF反應的必要因素［40］。腎小管周圍毛細血管內皮細胞是DN高糖缺氧損傷的重要靶點，具有向間充質細胞轉化的能力。暴露于DN缺氧微環境中的微血管內皮細胞，可激活TGF－β途徑誘導的內皮細胞間充質轉化反應，其內皮細胞的特異性表型標志物下調并轉化為成纖維細胞，造成微血管內皮功能紊亂及管周毛細血管稀疏，從而加劇腎小管間質缺氧損傷及TIF的病理過程［41］。

血管周細胞位于內皮細胞基底側，是構成腎間質微血管和組織間隙屏障的一部分，與內皮細胞共同維持腎小管周圍脈管系統的穩定。在糖尿病TIF發展過程中，周細胞不僅直接參與病理性血管收縮，并作為MyoF前體細胞之一，通過分化為MyoF而促進ECM的積累，促使間質纖維化瘢痕形成。周細胞具有維持毛細血管穩定性、完整性和通透性的作用，其缺乏可導致管周毛細血管稀疏，毛細血管氧氣和營養物質的輸送受損;內皮功能紊亂反過來加重腎小管間質損傷和腎小管萎縮，如此形成的惡性級聯反應促進糖尿病TIF的快速形成［42－43］。

2 微環境促進間質纖維化形成

2.1 MyoF來源與腎小管EMT 在腎纖維化的發病機制中，盡管MyoF不是唯一能夠分泌基質蛋白的細胞，但活化的MyoF通常被認為是產生基質的主要細胞［44］。腎臟MyoF的來源尚不清楚，目前認為MyoF來自腎周細胞、血管周圍成纖維細胞或間充質干細胞樣細胞以及骨髓來源細胞(巨噬細胞和纖維細胞)和內皮細胞［45］。而TEC通過EMT過程產生的MyoF占間質所有MyoF的比例尚存在爭議。長期暴露于炎癥和缺氧等微環境的TEC易受損而從細胞連接處釋放出來，逐漸失去上皮特征及上皮細胞標志物并獲得更多的間充質特征，遷移到腎小管外間質空間，最終活化為MyoF(即EMT)，大量ECM產生導致正常腎臟結構的破壞和腎功能的逐漸喪失［46］。有研究通過多種轉基因小鼠模型觀察到5%的腎臟MyoF來自經EMT的TEC［47］，而另有研究報道，約30%的MyoF來源于EMT［48］。

TEC的EMT主要依賴于EMT誘導轉錄因子的調控，EMT誘導轉錄因子可調節EMT各組成部分的表達［49］。長期的DN基礎及臨床研究發現，成纖維細胞生長因子－2作為促纖維化生長因子，可以誘導人TEC發生EMT，其特征表現為緊密連接和黏附連接的主要成分(ZO－1和E－cadherin)表達下調，TEC G2期阻滯并獲得纖維化的分泌表型［50－51］。EMT的激活導致細胞極性喪失，細胞間連接破壞，管狀基底膜降解以及細胞外基質重組，這一系列事件被稱為纖維化的宿主修復反應［52］。

EMT被認為是上皮和間充質表型之間的一組多重動態過渡狀態［53］。在EMT反應中，并非所有TEC都完成了向成纖維細胞表型的轉化。損傷后的TEC具有間質特征，能夠產生多種促纖維化因子和細胞因子，但仍附著在基底膜上，即“部分EMT”［54－57］。TEC轉化為MyoF的中間狀態反映了EMT轉錄驅動和抑制的微妙平衡。TEC的這種可塑性意味著EMT程序可能是一種可逆的細胞程序，它將上皮細胞暫時置于準間充質細胞狀態，并且在可逆過程中恢復到上皮狀態，而該細胞程序取決于特定的細胞環境以及細胞的生理或病理狀態［58］。研究表明，在TEC沒有完全轉化為MyoF的情況下，部分EMT足以通過觸發細胞周期停滯而導致TEC功能障礙，從而促進促纖維化細胞因子的分泌和纖維化［59－60］。關于損傷腎臟中MyoF的來源比例(EMT、內皮－間充質轉化、固有成纖維細胞、周細胞等)仍有爭議，但現已明確EMT所致的腎間質纖維化是DN的重要環節之一，而細胞EMT的機制還有待進一步研究。

2.2 MyoF活化微環境 腎纖維化病變在腎實質內并非均勻分布，通常起始于某些病灶部位［5－6］。這些部位通過特殊機制招募和富集可溶性促纖維化因子，激活并增殖間質成纖維細胞，進而產生大量的細胞外基質成分［61］。細胞黏合素C(tenascin－C，TNC)是一種外分泌型基質糖蛋白，參與細胞的增殖、分化、遷移、黏附、凋亡等過程，可與多種促纖維化因子結合，如TGF－β1、血小板衍生生長因子和成纖維細胞生長因子－2等［62］。TNC通過組織促纖維化微環境在MyoF激活中起重要作用。體外促纖維化因子音猬因子、TGF－β1、Wnt可刺激成纖維細胞表達TNC，而TNC可以選擇性地促進腎間質成纖維細胞的增殖及增殖相關基因的表達;體內在單側輸尿管梗阻或缺血再灌注損傷腎臟中的TNC表達迅速增加，并主要定位于腎間質中富含成纖維細胞的部位［61］。另有研究發現，TNC可與Wnt配體結合并從周圍環境中招募Wnt配體，隨后將其呈遞給鄰近細胞［63］。由此可見，TNC是促進MyoF活化微環境的主要組成部分，TNC在TIF過程中作為“分子海綿”從周圍微環境中募集促纖維化因子，其中包括TNC在內的基質細胞蛋白、纖維蛋白、糖蛋白、促纖維化因子(如TGF－β1、Wnt、音猬因子、腫瘤壞死因子－α)以及外泌體構成了MyoF活化和增殖微環境的主體［64］。這種微環境在介導TIF炎癥細胞浸潤、代謝紊亂、血管功能缺陷和TECs萎縮中起關鍵作用。

2.3 腎小管間質纖維化形成 在糖尿病腎臟炎癥、代謝紊亂、腎小管周圍血管微環境改變等一系列因素的交互作用下，多種類型固有腎臟細胞以及免疫細胞的參與共同導致DN間質纖維瘢痕形成及腎臟功能喪失。Janus激酶/信號轉導及轉錄激活因子、TGF－β/Smad、Wnt/β聯蛋白、環腺苷酸結合蛋白－Ras相關蛋白1等信號通路均參與調控EMT或ECM蛋白的表達，在TIF過程中起重要作用［65］，其中MyoF對TGF－β1非常敏感，TGF－β1是MyoF活化的主要調節因子［66］。

高血糖和晚期糖基化終末產物可導致腎臟細胞損傷死亡，通過模式識別受體引發炎癥反應，募集單核細胞并分化為炎癥巨噬細胞，驅動腎臟炎癥微環境形成［7］;高糖缺氧等環境促使間質血管內皮細胞和周細胞向成纖維細胞分化，增加了成纖維細胞的數量，造成管周毛細血管稀疏及間質缺血缺氧。受損內皮細胞也可通過Notch和Wnt信號通路促進成纖維細胞的激活［67］。內皮功能紊亂加重了TEC凋亡和腎小管萎縮，受損TEC被阻滯在細胞周期的G2/M期，產生和分泌促纖維化細胞因子并進一步吸引炎癥細胞進入腎小管間質，促使TEC向間充質表型轉變［68－69］。在基質糖蛋白TNC的“組織”下，各種促纖維化細胞因子富集并形成惡性循環，促使各種來源MyoF的活化并增殖，產生大量ECM，最終促使間質纖維化瘢痕的形成［6，27，55，61，67］。

3 小 結

TIF是腎臟纖維形成并導致腎衰竭的關鍵，也是DN進展至終末期腎病的必經過程。糖尿病TIF的形成并非單一的過程，而是一個復雜的動態過程。間質性炎癥反應是腎小管間質損傷自限性修復和進行性纖維化的始動因素。在炎癥、代謝紊亂微環境下，腎小管周圍微血管功能障礙，并可進一步加劇缺氧炎癥微環境，在上述因素的共同作用下，包括TEC在內的多種細胞轉分化為MyoF，形成惡性循環，最終導致腎小管萎縮和TIF。進一步闡明DN中TIF的具體過程和機制以及靶向調控DN不同微環境狀態中相應的病理過程，有助于精準治療并預防TIF或延緩DN進展。