視黃酸通路與顱面部器官發(fā)育的研究進(jìn)展

郭佩佩，王長琛，黃鑫，潘博

(中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院整形外科醫(yī)院整形七科，北京 100144)

脊椎動物的顱面部器官發(fā)育過程十分復(fù)雜，其形態(tài)發(fā)生包含骨、軟骨、結(jié)締組織等不同細(xì)胞類型的發(fā)育。有研究報道，顱面畸形是人類最常見的出生缺陷之一，1/3的先天性出生缺陷由顱面畸形引起[1]。顱面部畸形主要發(fā)生在妊娠前3個月，這是脊柱動物高度保守的發(fā)育窗口。多種信號通路和基因，如成纖維細(xì)胞生長因子信號通路、音猬因子(sonic hedgehog，SHH)信號通路、骨形態(tài)發(fā)生蛋白信號通路以及同源異型盒基因(homeobox genes，HOX)、轉(zhuǎn)錄因子性別決定區(qū)Y框相關(guān)基因(sex determining region Y-box gene，SOX)等，在神經(jīng)嵴細(xì)胞的誘導(dǎo)、遷移、增殖和分化過程中均發(fā)揮至關(guān)重要的作用，這些因子任意時間空間的特異性表達(dá)失調(diào)均會影響細(xì)胞的發(fā)育，從而影響正常器官形態(tài)的形成[2-3]。視黃酸是維生素A的活性代謝產(chǎn)物，通過結(jié)合受體調(diào)節(jié)多個靶基因的表達(dá)，以調(diào)控神經(jīng)嵴細(xì)胞的發(fā)育[4]。視黃酸通路調(diào)控紊亂可引起顱面部多種先天性畸形的發(fā)生?，F(xiàn)就近年來有關(guān)視黃酸信號通路與顱神經(jīng)嵴細(xì)胞發(fā)育關(guān)系的研究進(jìn)展予以綜述，進(jìn)一步闡述視黃酸信號通路與顱面部器官發(fā)育缺陷的關(guān)系，以期為今后的研究提供參考。

1 視黃酸信號通路

視黃酸是維生素A在生物體內(nèi)的代謝產(chǎn)物。維生素A主要存在于動物性食品(如肉和奶制品)中，橙色蔬菜中的胡蘿卜素也可以被分解為維生素A。根據(jù)視黃酸分子結(jié)構(gòu)中極性基團(tuán)及側(cè)鏈的不同，其可分為多種同分異構(gòu)體，包括全反式視黃酸、9-順式視黃酸、13-順式視黃酸等。全反式視黃酸是體內(nèi)典型視黃酸通路中的生物學(xué)活性形式[5]；9-順式視黃酸也是體內(nèi)具有生物學(xué)活性的形式；13-順式視黃酸又被稱為異維A酸，是皮膚科的常用藥物。視黃酸參與胚胎發(fā)育過程中的一系列生理過程，包括細(xì)胞增殖、凋亡和分化等，對成體動物的神經(jīng)、骨骼、血液及免疫系統(tǒng)等穩(wěn)態(tài)的維持有重要影響[4,6-7]。

視黃酸是一種脂溶性分子，在胚胎發(fā)生過程中由母體視黃醇產(chǎn)生。母體來源的視黃醇與視黃醇結(jié)合蛋白4結(jié)合后通過視黃酸誘導(dǎo)蛋白6進(jìn)入細(xì)胞。視黃酸誘導(dǎo)蛋白6是一種膜轉(zhuǎn)運體，負(fù)責(zé)結(jié)合并運送視黃醇-視黃醇結(jié)合蛋白復(fù)合體穿過細(xì)胞膜進(jìn)入靶細(xì)胞內(nèi)。被細(xì)胞攝取后的視黃醇與細(xì)胞內(nèi)的視黃醇結(jié)合蛋白結(jié)合后通過兩步反應(yīng)生成視黃酸[8]。第一步的氧化反應(yīng)由具有醇脫氫酶活性的酶催化產(chǎn)生視黃醛，此步驟主要通過短鏈脫氫酶家族的酶和中鏈脫氫酶家族的酶參與完成。第二步由視黃醛脫氫酶(retinaldehyde dehydrogenases，RALDH)將視黃醛氧化為視黃酸，這是影響視黃酸合成的限速步驟。共有4種RALDH在視黃酸的合成過程中具有重要作用，其中RALDH1、RALDH2和RALDH3參與全反式視黃酸的合成，而RALDH4參與體內(nèi)9-順式視黃酸的合成。研究表明，RALDH2是早期脊椎動物胚胎中此步驟的最主要參與者，在胚胎原腸胚時期即可檢測到[9]。細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生的視黃酸主要經(jīng)歷以下3種不同的生理過程。如果細(xì)胞內(nèi)有細(xì)胞色素氧化酶P450家族26亞家族(cytochrome P450 26 subfamily，CYP26)的酶類，視黃酸就會在胞質(zhì)中被羥基化，形成生物活性較低的極性代謝物，最終從細(xì)胞中清除。CYP26A1、CYP26B1和CYP26C1三個成員是體內(nèi)重要的視黃酸降解酶[5]。RALDH和CYP26分別具有合成和分解視黃酸的作用，并共同調(diào)控維持機(jī)體內(nèi)視黃酸的穩(wěn)態(tài)。若細(xì)胞中沒有CYP26，視黃酸則進(jìn)入細(xì)胞核，與胞核內(nèi)的受體結(jié)合，觸發(fā)靶基因的轉(zhuǎn)錄激活。視黃酸的核受體包含視黃酸受體(retinoic acid receptor，RAR)和視黃酸Ⅹ受體(retinoid Ⅹ receptor，RXR)[10]。脊柱動物的RAR和RXR均有α、β和γ亞型，每種亞型都有相應(yīng)的同分異構(gòu)體，并在不同組織或細(xì)胞中發(fā)揮作用。全反式視黃酸、13-順式視黃酸可與RAR結(jié)合，而9-順式視黃酸則可以與兩種受體結(jié)合。RAR和RXR可組成異構(gòu)二聚體RAR-RXR受體，在缺乏視黃酸的情況下，RAR-RXR受體與靶基因啟動子區(qū)域的視黃酸反應(yīng)元件結(jié)合，招募組蛋白脫乙?；妥瓒舻鞍滓种瓢谢蜣D(zhuǎn)錄；當(dāng)視黃酸存在時，視黃酸與受體結(jié)合并使其構(gòu)象發(fā)生改變，釋放阻遏蛋白并暴露出共激活因子結(jié)合位點，促進(jìn)靶基因的轉(zhuǎn)錄[11]。一個細(xì)胞中產(chǎn)生的視黃酸還可通過旁分泌的方式向鄰近細(xì)胞發(fā)出信號，介導(dǎo)非細(xì)胞自主效應(yīng)。

2 視黃酸在神經(jīng)嵴細(xì)胞發(fā)育中的作用

神經(jīng)嵴細(xì)胞是脊椎動物特有，起源于背側(cè)神經(jīng)管的一組可遷移的多潛能干細(xì)胞。顱神經(jīng)嵴細(xì)胞是神經(jīng)嵴細(xì)胞的一個子集，在顱面結(jié)構(gòu)的形成中起重要作用，構(gòu)成顱面部大多數(shù)組織結(jié)構(gòu)的細(xì)胞均由顱神經(jīng)嵴細(xì)胞衍生而來，包括神經(jīng)元細(xì)胞、肌成纖維細(xì)胞、黑素細(xì)胞、膠質(zhì)細(xì)胞、軟骨細(xì)胞和骨細(xì)胞等[12-13]。顱神經(jīng)嵴細(xì)胞的誘導(dǎo)、遷移、增殖、分化均需要嚴(yán)格時空信號網(wǎng)絡(luò)的調(diào)控，任何涉及調(diào)節(jié)顱神經(jīng)嵴細(xì)胞行為的信號失調(diào)均可能導(dǎo)致顱面畸形的發(fā)生。

在原腸胚時期，神經(jīng)嵴細(xì)胞位于神經(jīng)板邊緣和非神經(jīng)外胚層之間，通過上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化在神經(jīng)溝背側(cè)中線聚集形成神經(jīng)管，并與神經(jīng)上皮分離[14]。神經(jīng)嵴細(xì)胞的誘導(dǎo)過程需要神經(jīng)外胚層和非神經(jīng)外胚層以及下層近軸中胚層之間信號的相互作用。而神經(jīng)嵴細(xì)胞最早的標(biāo)志物，也是其誘導(dǎo)過程所必需的轉(zhuǎn)錄因子Gbx2則由包括視黃酸在內(nèi)的信號分子誘導(dǎo)產(chǎn)生[4,15]。視黃酸還參與脊椎動物神經(jīng)管發(fā)育的前后軸模式的形成。在胚胎原腸胚時期和早期體細(xì)胞形成時期，給予胚胎外源性視黃酸可以改變HOX編碼，并干擾神經(jīng)管前后模式的形成，破壞神經(jīng)嵴細(xì)胞的誘導(dǎo)過程[16-17]。

誘導(dǎo)并進(jìn)行上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化后的顱神經(jīng)嵴細(xì)胞可從間腦、中腦和菱腦(又稱后腦)部位沿特定路徑向腹側(cè)區(qū)域進(jìn)行廣泛而協(xié)調(diào)的運動。起源于間腦和中腦前部的顱神經(jīng)嵴細(xì)胞遷移至額鼻突并分化為鼻部、眼部、額骨和一部分上頜結(jié)構(gòu)。敲除視黃酸受體小鼠的神經(jīng)嵴細(xì)胞存活異常，導(dǎo)致不同程度的額骨、上頜骨和蝶骨融合缺陷等面中部發(fā)育不全表型出現(xiàn)[18]。視黃酸信號通路還通過對抗成骨因子的調(diào)節(jié)來調(diào)控成骨機(jī)制。外源性視黃酸可以改變成骨和破骨細(xì)胞之間的平衡，導(dǎo)致顱骨增厚[19]。

成對同源異型結(jié)構(gòu)域蛋白轉(zhuǎn)錄因子2是哺乳動物眼球發(fā)育的調(diào)控因子，其蛋白表達(dá)是神經(jīng)嵴細(xì)胞正常遷移所必需[20]。在早期遷移的神經(jīng)嵴細(xì)胞中，視黃酸信號通路增加或成對同源異型結(jié)構(gòu)域蛋白轉(zhuǎn)錄因子2表達(dá)下調(diào)會導(dǎo)致神經(jīng)嵴細(xì)胞凋亡及遷移的抑制，而抑制視黃酸的生物合成或過表達(dá)成對同源異型結(jié)構(gòu)域蛋白轉(zhuǎn)錄因子2也會干擾神經(jīng)嵴細(xì)胞的遷移，導(dǎo)致眼結(jié)構(gòu)及顱面發(fā)育的異常。外源性視黃酸處理胚胎可以改善過表達(dá)成對同源異型結(jié)構(gòu)域蛋白轉(zhuǎn)錄因子2a而引起的神經(jīng)嵴遷移抑制和細(xì)胞凋亡[16]。

起源于中腦后部和菱腦的顱神經(jīng)嵴細(xì)胞遷移到特定的腮弓。成纖維細(xì)胞生長因子信號通路和Wnt信號通路通過調(diào)控Cyp26的時間和空間表達(dá)，使視黃酸在菱腦部位形成一個前后表達(dá)不一的濃度梯度，引導(dǎo)著顱神經(jīng)嵴細(xì)胞的遷移[21-22]。鰓弓發(fā)育于咽兩側(cè)，內(nèi)側(cè)包繞內(nèi)胚層，外部覆以外胚層的上皮，能夠產(chǎn)生大量的顱面頭頸部結(jié)構(gòu)。位于第一鰓弓的顱神經(jīng)嵴細(xì)胞衍生為面部的上頜和下頜骨。上頜骨的形成依賴于成纖維細(xì)胞生長因子8介導(dǎo)的遠(yuǎn)端缺失同源盒1的表達(dá)[23]，而下頜骨受內(nèi)皮素-1誘導(dǎo)的遠(yuǎn)中缺失同源盒基因5和遠(yuǎn)中缺失同源盒基因6的表達(dá)調(diào)控[24]。神經(jīng)嵴誘導(dǎo)分層后的外源性視黃酸治療減少了鰓弓內(nèi)成纖維細(xì)胞生長因子8和內(nèi)皮素-1的表達(dá)，從而抑制上下頜骨結(jié)構(gòu)的發(fā)育[25-26]。顱神經(jīng)嵴細(xì)胞遷移分化為第二到第四鰓弓的過程由HOX家族基因表達(dá)決定，而視黃酸是菱腦中HOX基因的關(guān)鍵調(diào)控因子。如HOXA2在確定第二鰓弓方面起著至關(guān)重要的作用，而第三鰓弓的發(fā)育則與HOXA3的水平密切相關(guān)[27-28]。HOXA2的敲除或表達(dá)下調(diào)使第二鰓弓向第一鰓弓轉(zhuǎn)變，導(dǎo)致舌骨的丟失和第一鰓弓衍生的上下頜結(jié)構(gòu)的重復(fù)。妊娠早期HOXA2表達(dá)失調(diào)會導(dǎo)致外耳道復(fù)制和耳廓缺失，而胚胎晚期HOXA2表達(dá)失調(diào)會導(dǎo)致耳廓位置降低[29]。在原腸胚和早期體細(xì)胞形成期間，給予胚胎外源性視黃酸會改變HOX編碼，正常鰓弓結(jié)構(gòu)的形成被破壞，導(dǎo)致神經(jīng)嵴衍生結(jié)構(gòu)的畸形[30-31]。

3 視黃酸信號通路調(diào)節(jié)紊亂造成的顱面部發(fā)育畸形

胚胎內(nèi)的視黃酸依賴于母體供應(yīng)，其濃度的異常降低或升高均會導(dǎo)致胚胎先天性顱面表型的異常。胎兒體內(nèi)視黃酸濃度的降低會導(dǎo)致小頭畸形、唇裂、腭裂和小眼癥等。而母體攝入過量維生素A或暴露于視黃酸類似物也會導(dǎo)致小耳畸形、眼距過寬、小頜畸形、唇裂和腭裂等。視黃酸水平嚴(yán)重異常甚至?xí)?dǎo)致胚胎死亡。

3.1腭裂 在腭板的發(fā)育過程中，過量的視黃酸暴露會導(dǎo)致腭裂的發(fā)生。小鼠胚胎發(fā)育的第8.5天是顱神經(jīng)嵴細(xì)胞形成及遷移的時期，此時的視黃酸暴露可引起腭裂的發(fā)生。與胚胎的其他時期相比，胚胎第8.5天發(fā)生視黃酸暴露小鼠的腭裂發(fā)生率更高[32]。SHH信號通路的調(diào)控在腭突的生長發(fā)育模式形成過程中起著至關(guān)重要的作用。補(bǔ)充外源性視黃酸的胚胎腹側(cè)前腦區(qū)域的SHH信號顯著減少，使位于第一鰓弓的顱神經(jīng)嵴細(xì)胞發(fā)生凋亡，進(jìn)而導(dǎo)致腭裂及腭皺襞形態(tài)異常的發(fā)生。而通過化學(xué)激動劑恢復(fù)SHH信號可以減少顱神經(jīng)嵴細(xì)胞的凋亡，并降低腭裂的發(fā)生率[33-34]。對小鼠腭裂模型的研究表明，在腭上皮細(xì)胞和腭突間充質(zhì)細(xì)胞中，SHH信號通路通過抑制視黃酸的活性來維持正常的組織發(fā)育。在Shh基因條件性敲除的腭上皮細(xì)胞和腭突間充質(zhì)細(xì)胞中，視黃酸降解的生理過程被抑制，導(dǎo)致腭突和腭皺襞的發(fā)育異常[11]。另有研究報道，外源性視黃酸可能通過抑制Smad信號通路的激活來影響腭突間充質(zhì)細(xì)胞增殖，導(dǎo)致腭裂的發(fā)生[35]。

3.2胎兒酒精譜系障礙 胎兒酒精譜系障礙指因妊娠女性在妊娠期間攝入乙醇而導(dǎo)致胎兒出現(xiàn)的一組解剖畸形和神經(jīng)發(fā)育異常，其顱面部特征表現(xiàn)為上唇薄、人中平滑或長、瞼裂短、鼻梁低等。胎兒酒精綜合征是胎兒酒精譜系障礙疾病中較嚴(yán)重的類型，除上述特征性表型外，約60%的胎兒酒精綜合征患兒存在小頭畸形[36-37]。體內(nèi)的乙醇代謝產(chǎn)物可產(chǎn)生一系列影響胎兒正常發(fā)育的作用，如正常DNA甲基化模式改變、微RNA改變、細(xì)胞黏附、連接的變化以及多種生長信號轉(zhuǎn)導(dǎo)分子表達(dá)的改變等[38-40]。故推測，乙醇清除和視黃酸生物合成之間的酶競爭是產(chǎn)前乙醇暴露導(dǎo)致面部及小頭畸形的重要原因之一[8]。乙醇的氧化產(chǎn)物乙醛是RALDH2的有效底物。乙醛與視黃醛競爭RALDH2的酶活性區(qū)域，從而使視黃醛積累，視黃酸合成減少，最終導(dǎo)致胚胎發(fā)育過程中的顱面畸形[36]。在動物實驗中，乙醇暴露母體在補(bǔ)充維生素A或其代謝產(chǎn)物后，其體內(nèi)視黃酸信號通路相關(guān)基因的表達(dá)水平部分或全部恢復(fù)，在一定程度上防止了胚胎組織器官的發(fā)育畸形[41-42]。

3.322q11.2微缺失綜合征 22q11.2微缺失綜合征是人類最常見的一類臨床癥候群，以第22號染色體長臂上1.5 Mb～3 Mb的雜合缺失為遺傳學(xué)基礎(chǔ)[43]。22q11.2微缺失綜合征突出的臨床表現(xiàn)包括顱面畸形、先天性心臟病、腭裂、胸腺發(fā)育不全、免疫缺陷以及喂養(yǎng)困難、認(rèn)知、行為缺陷等。TBX1是22q11.2微缺失綜合征最重要的候選基因。在鰓弓的發(fā)育過程中，TBX1受到視黃酸的調(diào)控。小鼠體內(nèi)TBX1突變導(dǎo)致RALDH2表達(dá)異常及Cyp26表達(dá)下調(diào)，視黃酸水平升高引起鰓弓發(fā)育缺陷，導(dǎo)致顱面和心臟畸形[22]。在胚胎發(fā)育中，視黃酸誘導(dǎo)蛋白6表達(dá)于多種組織，包括鰓弓上皮。人類視黃酸誘導(dǎo)蛋白6基因突變導(dǎo)致眼部結(jié)構(gòu)缺陷、腭裂、耳畸形等多種顱面器官畸形，并可導(dǎo)致與22q11.2微缺失綜合征相似的表型，如心臟和認(rèn)知行為發(fā)育缺陷等[44]。

3.4CHARGE綜合征 CHARGE綜合征是CHD7基因雜合突變引起的一類先天性多器官畸形綜合征，主要癥狀包括眼畸形、心臟畸形、后鼻孔閉鎖、生長發(fā)育遲滯、生殖器發(fā)育不全、耳畸形及聽力障礙等[45]。在胚胎發(fā)育過程中，視黃酸信號的失調(diào)會導(dǎo)致類似于CHARGE綜合征的發(fā)育缺陷。而視黃酸生物合成抑制劑可以修復(fù)CHD7敲除小鼠的內(nèi)耳畸形[46]。有研究表明，CHD7作用于視黃酸合成酶RALDH3的上游，可直接調(diào)控其表達(dá)，而RALDH3基因的缺失可部分挽救CHD7突變小鼠的內(nèi)耳缺陷表型[47]。

3.5胎兒寨卡綜合征 通過母嬰傳播而引起的先天性寨卡病毒感染會引起胎兒一系列功能和結(jié)構(gòu)的先天缺陷，稱為胎兒寨卡綜合征，包括癲癇發(fā)作、先天性攣縮、椎體外系病變、宮內(nèi)生長發(fā)育受限、顱面及小頭畸形等[48]。有學(xué)者在寨卡病毒基因組中發(fā)現(xiàn)了與視黃酸反應(yīng)元件一致的序列，并推測這些病毒的罕見序列與細(xì)胞核中的RXR-RAR異源二聚體結(jié)合，導(dǎo)致視黃酸信號減少，并干擾了胚胎發(fā)育期間正常的基因調(diào)控，引起胎兒寨卡綜合征中的小頭畸形表型[49]。

4 小 結(jié)

脊椎動物顱面器官的發(fā)育是一個十分復(fù)雜的過程，涉及不同階段、不同空間的多種信號分子與周圍組織間的協(xié)調(diào)作用。視黃酸信號通路對于胚胎正常發(fā)育，特別是顱面部器官的發(fā)育具有重要作用。在顱神經(jīng)嵴細(xì)胞誘導(dǎo)、遷移及分化成顱面部各種突起的過程中，視黃酸信號通路的相關(guān)分子突變或表達(dá)異常均可能阻礙神經(jīng)嵴細(xì)胞的活動，造成顱面組織形態(tài)的發(fā)育缺陷。目前有關(guān)視黃酸通路在顱面器官形態(tài)發(fā)生過程發(fā)揮作用的具體機(jī)制的研究仍處于探索階段。