膿毒癥骨骼肌萎縮機制的研究進展

殷丹丹，吳進，蔣鵬

(1.江蘇大學附屬醫院麻醉科，江蘇 鎮江 212001； 2.江蘇大學醫學院，江蘇 鎮江 212001)

膿毒癥是一種以全身炎癥反應和組織損傷為特征的臨床綜合征，可導致機體循環衰竭、多器官功能障礙甚至死亡，是危重癥領域的重大難題之一，每年影響全世界數百萬人的健康，甚至危及生命[1-2]。膿毒癥時，急性分解代謝反應可導致機體能量儲存快速動員(包括肌肉、糖原和脂質儲存被分解)，驅動糖異生[3]。其中，骨骼肌占人體細胞質量的50%～60%[4]，是受高分解代謝影響最大的組織。分解代謝刺激的持續存在顯著影響骨骼肌間室的穩態，導致呼吸肌及四肢運動肌肉萎縮、瘦體重快速降低，同時產生呼吸肌效率低下、通氣不足、呼吸衰竭、脫機困難、肌肉關節功能障礙、運動受限等嚴重臨床并發癥，甚至危及生命[5]。臨床診療過程中，醫護人員常通過調整患者飲食結構、營養支持治療、肌肉關節功能鍛煉等方法預防和治療骨骼肌肉萎縮，但效果并不顯著。研究表明，蛋白質降解水平升高、合成水平降低是導致膿毒癥骨骼肌萎縮的重要原因[6-7]。但激素、炎癥因子、氧化應激等因素對膿毒癥骨骼肌萎縮的潛在作用機制目前尚未完全闡明，且對骨骼肌萎縮的深入研究仍存在諸多爭議。現就膿毒癥骨骼肌萎縮機制的研究進展予以綜述。

1 蛋白質降解

蛋白質降解在細胞生物活動中占重要地位。骨骼肌蛋白質降解途徑主要包括泛素-蛋白酶體系統、自噬-溶酶體途徑、鈣蛋白酶和胱天蛋白酶(caspase)，在膿毒癥肌肉萎縮中起主要作用的是泛素-蛋白酶體系統和自噬-溶酶體途徑[8-9]。

1.1泛素-蛋白酶體系統 泛素-蛋白酶體系統是細胞內蛋白質降解的主要途徑。泛素修飾是一個由泛素活化酶E1、泛素結合酶E2和泛素連接酶E3三種酶進行的ATP依賴性過程，首先由E1激活泛素，然后活化的泛素與E2結合，再由E3將泛素的活化形式從E2轉移至底物的賴氨酸殘基上；E3能識別底物N端殘基、特定的磷酸化域或破壞盒，是底物特異性的主要決定因素，在確定蛋白酶體降解目標蛋白方面起重要作用[10]。最后，經過多聚泛素鏈標記的蛋白質被多亞基26S蛋白酶體(由核心亞基20S和兩端調控復合體19S組成)識別并降解[11]。

骨骼肌中存在兩種肌特異性E3泛素連接酶，即肌肉萎縮盒F蛋白(muscle atrophy F-box，MAFbx)和肌肉環指蛋白1(muscle ring finger protein 1，MuRF1)。有研究發現，在盲腸結扎穿孔膿毒癥模型中，大鼠萎縮的趾長伸肌腱中的MAFbx、腓腸肌中的MuRF1信使RNA表達量分別增加10倍和4倍[12-13]。由此推測，機體感染膿毒癥時MAFbx和MuRF1基因表達增加，肌萎縮程序啟動，導致泛素-蛋白酶體系統激活，肌肉蛋白降解。

機體中的肌纖維可分為快肌纖維和慢肌纖維，這種肌纖維的差異性導致肌萎縮程度不同。Morel等[14]在小鼠膿毒癥模型中發現，與膈肌相比，四肢運動肌肉更易發生肌肉萎縮，這與膿毒癥四肢運動肌泛素-蛋白酶體系統活化有關。盲腸結扎穿孔術后1 d，SD大鼠腓腸肌和膈肌中MuRF-1、MAFbx信使RNA的表達水平均顯著升高，但腓腸肌的轉錄應答顯著高于膈肌，主要原因為呼吸肌中慢肌纖維的比例和線粒體密度均高于運動肌，因此其抗氧化代謝能力是四肢肌肉的數倍，所以在大鼠的肌萎縮中，與運動肌相比，呼吸肌更具萎縮抵抗性[15]。

1.2自噬溶酶體途徑 自噬-溶酶體途徑主要負責細胞質蛋白和細胞器的降解,包括線粒體和過氧化物酶體等。根據細胞物質運送至溶酶體途徑的不同，自噬可分為巨自噬、分子伴侶介導的自噬和微自噬，其中只有巨自噬參與肌肉萎縮[16]。巨自噬(簡稱自噬)是一種基因調控、高度保守的細胞降解過程，由內質網來源的脂膜包繞待降解物質形成自噬小體，然后與溶酶體融合并降解其內容物，以滿足細胞自身能量代謝需求并更新老化、損傷的細胞器。機體感染膿毒癥時，部分器官系統的自噬水平會發生顯著改變。研究證實，自噬在各臟器系統中發揮不同的作用，但在骨骼肌中自噬導致肌肉萎縮的作用機制還存在爭議[17]。

在自噬膜起始階段，UNC-51樣激酶(UNC-51-like kinase，ULK)-1與自噬相關蛋白13、FAK家族互作蛋白200形成復合物，受AMP活化蛋白激酶(AMP-activated protein kinase，AMPK)和哺乳動物雷帕霉素靶蛋白復合物1(mammalian target of rapamycin complex 1，mTORC1)雙重調控，調節機體自噬水平；惡病質時，AMPK可磷酸化ULK-1絲氨酸555位點，激活自噬，但在營養充足狀態下，哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mechanistic target of rapamycin，mTOR)可磷酸化ULK-1絲氨酸757位點，干擾ULK-1與AMPK的交互作用，抑制細胞自噬[18]。Stana等[8]研究證明，與膈肌相比，膿毒癥小鼠脛骨前肌萎縮的持續時間更長，且與脛骨前肌中高水平自噬有關。由此認為，膿毒癥時機體自噬-溶酶體途徑的持續激活是導致肌肉萎縮的原因之一，自噬-溶酶體途徑通過抑制mTOR激活AMPK相關信號通路，誘導骨骼肌高水平自噬，促進膿毒癥肌纖維萎縮。而Chen等[19]認為，激活自噬有利于清理功能失調的細胞器和有毒的損傷蛋白質，防止由損壞的細胞器積累導致的肌肉萎縮和功能障礙，相反，抑制骨骼肌自噬可導致神經肌肉功能障礙。還有研究表明，出現敗血癥、癌癥等惡病質狀態時，機體可通過c-Jun氨基端激酶途徑誘導B細胞淋巴瘤/白血病-2(B-cell lymphoma/leukemia-2，Bcl-2)磷酸化，導致Bcl-2失活并與Beclin-1蛋白解離，發揮誘導自噬的作用[20]。Bcl-2與Beclin-1蛋白的BH3結構域結合，以復合物形式調控自噬體成核階段，在正常生理條件下，Bcelin-1、Bcl-2結合穩定，維持細胞穩態，而處于應激狀態時，Bcl-2的絲氨酸70、87和酪氨酸69位點發生磷酸化，Bcl-2與Beclin-1解離，誘導細胞自噬[21]。微管相關蛋白1輕鏈3B、ULK-2、自噬相關蛋白12、Beclin-1等自噬不同階段相關基因均受叉頭框蛋白(forkhead box protein，Fox)O3轉錄因子的調節[9,22]。在C2C12細胞來源的肌管、離體小鼠肌肉或肌纖維中，過表達FoxO3可增加自噬小體形成，而特異性敲除FoxO3則可抑制自噬[23]。另外，外源性補充亮氨酸等必需氨基酸，可通過抑制骨骼肌自噬信號通路，預防膿毒癥引起的肌肉蛋白降解[24]。綜上可知，發生膿毒癥時機體骨骼肌系統過度自噬是有害的，自噬-溶酶體途徑與其他蛋白質降解途徑可發揮協同作用，導致機體肌肉萎縮。

1.3鈣蛋白酶和caspase 細胞內Ca2+主要貯存于肌細胞線粒體和肌質網，作為第二信使，介導細胞內信號轉導，產生生物學效應。鈣蛋白酶是Ca2+信號的特異性受體，位于骨骼肌細胞質中，通常以非活性形式存在，主要受Ca2+和內源性抑制因子鈣蛋白酶抑制蛋白的調控。鈣蛋白酶在肌節Z線中濃度最高，當細胞環境中的Ca2+水平增高時，可激活鈣蛋白酶，使Z線發生特異性局部降解，破壞肌節，釋放出肌絲，粗、細肌絲被胞質蛋白酶或溶酶體系統進一步降解，導致殘留的肌原纖維的收縮力量減弱[11]。由此認為，在肌肉萎縮過程中，肌原纖維蛋白的降解至少需要協同兩個及以上蛋白水解系統，鈣蛋白酶可作為泛素-蛋白酶體系統的上游而發揮作用。Supinski等[25]發現，在C2C12細胞系炎癥模型和小鼠盲腸結扎穿孔模型中，炎癥細胞因子可誘導鈣依賴磷脂酶A2活化，激活鈣蛋白酶水解系統，增強線粒體自由基生成，致使細胞活力降低，小鼠膈肌功能障礙。同時，Supinski等[26]證實，牛磺酸可促進鈣吸收，預防膿毒癥引起的骨骼肌功能障礙。而Qiu等[27]發現，鈣通道拮抗劑丹曲林對膿毒癥引起的膈肌功能障礙具有保護作用，這與丹曲林下調高遷移率族蛋白B1、抑制鈣蛋白酶-caspase-3蛋白水解途徑有關。

caspase途徑是凋亡細胞的主要降解途徑，通常以酶原形式存在于正常細胞中，在凋亡程序啟動后被激活。目前認為，caspase與膿毒癥機體失控性炎癥反應顯著相關，在淋巴器官和組織凋亡中扮演重要角色[28]。有學者提出，膿毒癥通過兩步誘導肌肉蛋白加速分解：①通過鈣蛋白酶和(或)caspases裂解肌原纖維蛋白；②通過泛素-蛋白酶體系統和自噬-溶酶體途徑進一步降解[29]。研究發現，與野生型小鼠相比，caspase-3敲除小鼠的失用性肌肉萎縮程度顯著減輕，同時肌細胞凋亡和炎癥水平顯著降低，證明caspase-3在失用性肌萎縮中發揮重要作用[30]。

2 蛋白質合成

磷脂酰肌醇-3-激酶(phosphatidylinositol-3 kinase，PI3K)是胞內重要的信號轉導分子，可活化多個下游信號蛋白，其中蛋白激酶B(protein kinases B，PKB/Akt)是PI3K下游的主要效應物。研究表明，PI3K/Akt主要通過mTORC1信號通路激活蛋白質合成[31-32]。mTOR是細胞內的主要生長調節因子，以兩種多蛋白復合體存在，其中mTORC1可磷酸化下游效應蛋白p70核糖體蛋白S6激酶和真核翻譯起始因子4E結合蛋白1，調控核糖體蛋白S6和真核翻譯起始因子4E活性，促進信使RNA翻譯[33]。Shi等[32]研究發現，在膿毒癥大鼠萎縮的腓腸肌中AMPK高度磷酸化，顯著抑制了mTOR/核糖體蛋白S6激酶合成通路。Wu等[34]發現，盲腸結扎穿孔建模3 d后，膈肌PI3K/Akt信號活化受到抑制，給予SD大鼠尾靜脈注射重組人神經調節蛋白-1β可通過激活PI3K/Akt/mTOR信號通路減輕膈肌萎縮，緩解膈肌收縮功能障礙。

膿毒癥患者機體蛋白質合成總體水平降低，除蛋白合成途徑被抑制外，轉錄因子調節也是重要原因之一。FoxO轉錄因子活性受翻譯后修飾的調控，包括磷酸化、乙酰化和泛素化，而胰島素樣生長因子1等介導的PI3K/Akt信號通路可誘導FoxO磷酸化，使其由胞核轉運至胞質，下調MuRF1、MAFbx以及自噬相關基因的轉錄和表達[35-36]。過表達FoxO3的小鼠肌肉質量顯著減少[37]；與野生型小鼠相比，特異性過表達FoxO1基因的小鼠骨骼肌質量降低，Ⅰ型肌肉結構蛋白相關基因表達減少，表明FoxO1負調控骨骼肌質量和肌纖維基因表達，骨骼肌功能受損[38]。

3 激素調節

內分泌環境失調是肌肉萎縮、蛋白質水解以及抑制肌肉再生的主要原因。多種激素參與調控骨骼肌蛋白質合成-分解代謝和糖代謝以及損傷后肌肉質量的維持和修復。生長激素、胰島素樣生長因子1、甲狀腺素、糖皮質激素等對骨骼肌的生長和功能均有重要作用。其中，胰島素樣生長因子1是維持骨骼肌質量的主要刺激因子，可使具有酪氨酸激酶活性的四聚跨膜受體底物的酪氨酸殘基磷酸化，進而通過Akt/mTOR和Akt/FoxO途徑促進蛋白質合成，抑制蛋白質降解[39]。另外，胰島素樣生長因子1和同型機械生長因子還可促進骨骼肌細胞增殖。膿毒癥時，在炎癥因子、脂源性因子、胰島素拮抗激素等因素的影響下，機體產生嚴重胰島素抵抗，一方面可抑制細胞內胰島素信號轉導，另一方面減弱骨骼肌細胞等胰島素敏感組織對胰島素調節的正常生理反應[40]。在臨床診療過程中，Hermans等[41]發現，與傳統治療方法相比，對危重癥肌病或長時間行機械通氣的患者行強化胰島素治療可顯著降低肌無力的發生率。

另外，Costelli和Baccino[42]證明，膿毒癥機體高分解代謝狀態與循環糖皮質激素水平升高密切相關。膿毒癥時，糖皮質激素受體的表達和活性顯著增加，使用糖皮質激素受體拮抗劑RU38486可預防肌肉萎縮，這與在炎癥性疾病中使用高劑量糖皮質激素持續性治療導致的肌肉萎縮現象一致[43]。糖皮質激素受體是一種Ⅰ型核激素受體，定位于胞質，與相應配體結合后，糖皮質激素受體轉移到細胞核中，與糖皮質激素反應元素的特定DNA序列相互作用，介導基因轉錄[39]。Braun等[44]發現，與對照小鼠相比，糖皮質激素受體特異性敲除型小鼠更能抵抗膿毒癥引起的骨骼肌萎縮。這些結論表明，糖皮質激素是炎癥性肌肉萎縮的影響因素。

糖皮質激素還可刺激快肌纖維中肌生成抑制素myostatin(骨骼肌發育的負調節因子)的生成，誘導骨骼肌萎縮[39]。對糖皮質激素調控膿毒癥骨骼肌萎縮機制的進一步研究發現，糖皮質激素主要通過糖皮質激素受體二聚化、核定位和轉錄激活而發揮作用[44]。高水平糖皮質激素可降低萎縮性肌病患者肌肉中胰島素樣生長因子1的局部生成，并抑制蛋白合成氨基酸信號通路[39]。與野生型小鼠相比，MuRF-1敲除型小鼠可抵抗地塞米松誘導的肌肉萎縮，維持骨骼肌質量和收縮性能[45]。此外，糖皮質激素還可激活鈣蛋白酶系統，促進肌原纖維骨架蛋白水解[46]。以上結論表明，糖皮質激素是調節肌肉萎縮的重要因子。

4 炎癥介質與氧化應激

膿毒癥時，機體失控性炎癥反應(尤其是循環高腫瘤壞死因子-α水平)被證實是機體蛋白損失的關鍵驅動因素[47]。研究表明，機體蛋白損失與核因子κB(nuclear factor-κB，NF-κB)信號通路有關，NF-κB通過上調MuRF-1和MAFbx信使RNA的表達，激活機體泛素-蛋白酶體系統，導致蛋白質降解水平顯著升高[47-48]。NF-κB家族由p50、p52、REL(cREL)、REL-A(p65)和REL-B組成，蛋白質形成同源或異源二聚體后成為具有功能的NF-κB，可轉位至胞核內與DNA相結合，誘導靶基因轉錄[47]。特異性敲除IκB激酶β可緩解小鼠肌肉萎縮，表明NF-κB催化亞基IκB激酶β在肌萎縮中發揮重要作用[49]。除腫瘤壞死因子-α外，白細胞介素(interleukin，IL)-6在細胞分化、蛋白損失中也扮演重要角色。骨骼肌可局部產生IL-6，并根據不同的生理病理刺激而系統釋放，IL-6自分泌可促進肌源性分化；在失控性炎癥反應中，IL-6水平升高可促進肌肉萎縮[47]。Pelosi等[50]發現，IL-6可通過p90核糖體蛋白S6激酶/真核生物翻譯延長因子2和mTOR/p70核糖體蛋白S6激酶通路抑制C2C12細胞系肌源性分化，其中，p90核糖體蛋白S6激酶可獨立于mTOR/p70核糖體蛋白S6激酶通路，磷酸化下游真核細胞延伸因子2激酶，使其失活；真核細胞延伸因子2激酶可催化其唯一底物真核細胞延伸因子2蘇氨酸56位點，使其磷酸化，降低與核糖體結合的能力，抑制肽鏈延伸。此外，IL-6水平升高與多發性肌炎、皮肌炎等疾病的嚴重程度呈顯著正相關[47]。以上結論表明，炎癥介質(如腫瘤壞死因子-α、IL-6)在肌肉萎縮中起重要作用。

線粒體超微結構異常、電子呼吸傳遞鏈功能障礙被認為是膿毒癥肌肉萎縮的基礎[51-53]。線粒體是細胞能量代謝的重要場所，呼吸鏈產生的超氧陰離子是活性氧類的主要成分，也是活性氧類的最主要來源，而膿毒癥機體內源性活性氧類的產生同樣可增強NF-κB活性，導致肌肉萎縮[47,52]。Odeh等[54]發現，與對照小鼠相比，p38α突變型小鼠肌肉組織中氧化應激信號及泛素化蛋白水平均顯著降低，證明了p38α促分裂原活化的蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)可促進骨骼肌萎縮。MAPK是高度保守的蛋白激酶家族，其中p38是控制炎癥反應最重要的成員。在小鼠盲腸結扎穿孔建模前預注射非瑟酮，可通過抑制p38 MAPK磷酸化，降低機體IL-1、IL-6和腫瘤壞死因子-α水平[55]。此外，研究證明，抑制p38 MAPK活性還可下調MuRF-1和MAFbx表達，預防肌纖維萎縮[48]。

5 其 他

Jiao等[56]研究證明，膿毒癥大鼠膈肌功能障礙與內質網應激增加有關，并認為在內質網應激過程中，內質網功能受損和Ca2+流量失調是導致肌肉功能障礙的原因之一。有研究發現，在去神經支配、癌癥惡病質、糖尿病、腎衰竭引起的肌肉萎縮模型中，嚙齒動物肌肉過氧化物酶體增殖物激活受體γ輔助活化因子1α(peroxisome proliferator-activated receptor γ coactivator-1α，PGC-1α)信使RNA水平降低[57-60]。PGC-1α在維持骨骼肌肉功能中發揮重要作用。PGC-1α通過抑制FoxO3與MAFbx啟動子的結合而抑制依賴FoxO3的骨骼肌萎縮轉錄通路，與對照小鼠相比，過表達PGC-1α的轉基因小鼠肌肉纖維萎縮程度降低[61]。此外，炎癥因子風暴是膿毒癥初始階段死亡的主要原因之一，激活PGC-1α可降低機體IL-6水平，保護線粒體功能[54]。苯扎貝特是一種過氧化物酶體增殖物激活受體激動劑，可增加PGC-1α的表達，對試驗性膿毒癥具有抗炎作用[62]。然而，苯扎貝特對膿毒癥的保護作用目前尚不明確。

6 小 結

膿毒癥機體氧化應激、炎癥介質、內分泌激素水平改變等均參與蛋白質代謝的調節。一方面由于蛋白質合成信號減弱、RNA轉錄水平調控等導致蛋白質合成減少；另一方面，機體應激狀態可通過鈣蛋白酶、caspase、泛素蛋白酶體途徑以及自噬溶酶體途徑等導致蛋白降解水平增加。在諸多因素影響下，膿毒癥時蛋白質處于高分解代謝狀態，導致骨骼肌肌肉質量損失。此外，氧化應激、內質網應激、線粒體DNA損傷、線粒體電子呼吸鏈受損等也可導致骨骼肌功能障礙。PGC-1α是新的蛋白質代謝調節因子，深入研究其在蛋白質代謝中的作用機制，可為臨床治療膿毒癥肌病提供新思路。