軟骨細胞周基質(zhì)及其參與力學信號轉(zhuǎn)導的研究進展

楊崢，何樂人

(中國醫(yī)學科學院北京協(xié)和醫(yī)學院整形外科醫(yī)院耳再造一中心，北京 100144)

1925年細胞周基質(zhì)(pericellular matrix，PCM)在軟骨組織中被首次發(fā)現(xiàn)[1]，PCM從細胞膜表面向外延伸數(shù)微米并環(huán)形包繞細胞的基質(zhì)條帶[2]，廣泛存在于紅細胞、內(nèi)皮細胞、上皮細胞、軟骨細胞、平滑肌細胞等[3]。PCM的主要成分是富電荷的蛋白多糖，蛋白多糖易于水化、含水量高[4]，在常規(guī)組織切片制備過程中蛋白多糖易被破壞，因此在傳統(tǒng)相差顯微鏡和微分干涉顯微鏡下難以觀察PCM[5]，限制了PCM相關(guān)研究。隨著紅細胞固定對比顯像、納米視頻增強顯微技術(shù)、示蹤速度測量學等觀察和研究方法的改進[3]，人們對于PCM組成、結(jié)構(gòu)和功能的研究逐漸深入，其在細胞內(nèi)外信號轉(zhuǎn)導和細胞表面生化活動中發(fā)揮的重要作用得到揭示。近年來關(guān)于PCM的研究主要集中于腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移[6]、骨與軟骨損傷的修復和再生[4]、心血管疾病[7]等方面，其在細胞運動[8]、細胞分化[6,9]、微環(huán)境維持[10]、力學傳導[11]等活動中發(fā)揮作用。PCM有助于維持軟骨結(jié)構(gòu)和力學特性，作用涉及軟骨的發(fā)育、退化、修復、再生等，提示PCM在軟骨相關(guān)疾病中有重要作用[12-14]，可應(yīng)用于軟骨組織工程[15-16]。現(xiàn)就軟骨PCM組成結(jié)構(gòu)和生物力學相關(guān)的研究進展，以及PCM成分、作用及參與力學信號轉(zhuǎn)導的機制進行綜述。

1 PCM的主要成分

軟骨組織中，PCM與其所包裹的軟骨細胞共同構(gòu)成軟骨單位[17]。隨著機械法和酶消化法的改進，軟骨單位的分離日益便捷，這為研究PCM奠定了基礎(chǔ)[18]。作為軟骨細胞與細胞外基質(zhì)的連接成分，PCM位于軟骨細胞與細胞外基質(zhì)之間，厚度為1～5 μm，在軟骨組織的不同區(qū)域，包裹數(shù)目不同的同源軟骨細胞群[3,19]。

PCM的主要成分是Ⅵ型膠原和蛋白聚糖[20]。與細胞外基質(zhì)相比，PCM含有特異性的Ⅵ型膠原[20]，含量更高的基底膜蛋白多糖[21]、蛋白多糖單體或低聚物[22]、透明質(zhì)酸[23]、二聚糖[24]、Ⅸ型膠原[25]等。組成的差異影響了基質(zhì)的特性，隨著軟骨細胞空間排列的變化，PCM和細胞外基質(zhì)的彈性變化并不同步[14]。

1.1Ⅵ型膠原 Ⅵ型膠原是PCM的特異性成分，分布于軟骨組織，常作為軟骨單位和PCM的特有標志物。與其他類型膠原相比，Ⅵ型膠原在結(jié)構(gòu)和功能不同，進而影響著PCM的構(gòu)成和功能。結(jié)構(gòu)上，Ⅵ型膠原在細胞內(nèi)組裝為四聚體，無乙醛介導的交聯(lián)[26]，通過整合素α3β1和跨膜蛋白多糖神經(jīng)膠質(zhì)抗原2錨定在軟骨細胞膜上，形成獨立的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)[27]。功能上，Ⅵ型膠原的存在影響PCM的發(fā)育和軟骨組織的生物力學性質(zhì)，促進軟骨細胞的增殖和組織再生，對軟骨細胞具有炎癥保護作用[28]。在Ⅵ型膠原基因敲除的小鼠中，關(guān)節(jié)軟骨中PCM形成受阻、剛度降低，骨關(guān)節(jié)炎進程加快[29]。Smeriglio等[30]的研究發(fā)現(xiàn)，培養(yǎng)基中添加Ⅵ型膠原能夠促進軟骨細胞增殖，但將Ⅵ型膠原鋪于培養(yǎng)皿底則無此作用；可溶性Ⅵ型膠原的促增殖作用在骨髓來源的間充質(zhì)干細胞中亦得到證實[31]，提示Ⅵ型膠原以某種結(jié)構(gòu)形式參與細胞增殖的受體-配體反應(yīng)。在軟骨組織的不同區(qū)域，PCM的形態(tài)不同，而在PCM區(qū)域，Ⅵ型膠原的分布亦不均一，這種差異性分布與PCM不同區(qū)域彈性模量的遞變直接相關(guān)[1]。Ⅵ型膠原作為PCM的主要成分，在同一軟骨單位、不同軟骨單位間的含量差異是構(gòu)成PCM空間分布差異的基礎(chǔ)。

1.2基底膜蛋白多糖 基底膜蛋白多糖是一種大分子硫酸乙酰肝素蛋白多糖，通過HS鏈與Ⅵ型膠原結(jié)合，與Ⅵ型膠原共定位于PCM區(qū)域[32]。與Ⅵ型膠原分布相同，基底膜蛋白多糖分布呈梯度變化，主要聚集在PCM靠近軟骨細胞的區(qū)域[33]。

基底膜蛋白多糖可與纖維連接蛋白和層粘連蛋白相互作用，通過HS鏈傳遞電子[34]，與硫酸乙酰肝素一起作為成纖維細胞生長因子-2(fibroblast growth factor-2，F(xiàn)GF-2)的胞外基質(zhì)儲備庫，通過釋放FGF-2起到力學傳導作用[35]，基底膜蛋白多糖及其參與的力-化學信號轉(zhuǎn)導是PCM力學性質(zhì)的基礎(chǔ)。Wilusz等[33]利用結(jié)合免疫熒光標記的原子力顯微鏡檢測發(fā)現(xiàn)，PCM中靠近軟骨細胞的內(nèi)部區(qū)域的彈性模量較外周區(qū)域低，這一趨勢與基底膜蛋白多糖在PCM內(nèi)部區(qū)域和外周區(qū)域的分布差異一致，提示基底膜蛋白多糖參與降低軟骨細胞周圍的彈性模量。Xu等[36]利用原子力顯微鏡檢測小鼠軟骨細胞和周圍基質(zhì)硬度發(fā)現(xiàn)，敲除基底膜蛋白多糖的小鼠軟骨細胞和PCM硬度顯著降低，提示基底膜蛋白多糖在維持軟骨力學性質(zhì)上不可或缺。基底膜蛋白多糖在PCM不同區(qū)域表現(xiàn)出分布差異，進而影響PCM的機械性質(zhì)，這是PCM傳導力學信號的基礎(chǔ)。

1.3其他成分 近年來利用蛋白組學[37-38]、免疫熒光定位、雙向電泳和質(zhì)譜分析等技術(shù)在PCM中發(fā)現(xiàn)了更多成分，包括血管性血友病因子A結(jié)構(gòu)域相關(guān)蛋白、三磷酸異構(gòu)酶、轉(zhuǎn)化生長因子-β-誘導蛋白、轉(zhuǎn)化生長因子-β-結(jié)合蛋白-2[18]、Ⅺ型膠原[39]等。免疫熒光定位檢測發(fā)現(xiàn)以上成分位于PCM區(qū)域，與Ⅵ型膠原和基底膜蛋白多糖共同構(gòu)成PCM，維持軟骨微環(huán)境的穩(wěn)態(tài)。

PCM結(jié)構(gòu)和成分的穩(wěn)定保證了軟骨組織微環(huán)境穩(wěn)態(tài)，感知和響應(yīng)生物力學微環(huán)境的擾動，維持基質(zhì)穩(wěn)態(tài)和細胞間交流[3]。Wilusz和Guilak[40]的研究發(fā)現(xiàn)，PCM對于酶的消化有高度抵抗作用，彈性蛋白酶消化部分蛋白聚糖、膠原蛋白后，PCM彈性模量降低24%，而PCM的微機械性能不受軟骨素酶、聚蛋白多糖酶、透明質(zhì)酸酶消化的影響。de Vries等[41]發(fā)現(xiàn)，體外培養(yǎng)的軟骨細胞隨著基質(zhì)的沉積和增厚，PCM的楊氏模量逐漸增高，相同機械加載條件下細胞變形顯著降低，表明PCM的穩(wěn)定對軟骨細胞變形有保護作用。另一方面，PCM的組成和結(jié)構(gòu)不是一成不變的。PCM參與軟骨細胞-基質(zhì)間信號轉(zhuǎn)導，通過修飾生長因子或其他信號分子作用于軟骨細胞，影響對代謝和刺激信號的反應(yīng)[42]。此外，PCM的超分子結(jié)構(gòu)也會隨細胞和環(huán)境的變化而改變[34]，在細胞分裂和細胞黏附中，蛋白聚糖和透明質(zhì)酸的分布、類型及空間組織結(jié)構(gòu)隨胞膜形態(tài)和細胞形變而改變[43-44]。

體外培養(yǎng)的軟骨細胞中，PCM的組裝積累和重構(gòu)是軟骨細胞行為的重要部分，PCM的成分及其分布能夠反映軟骨細胞的活力、增殖和代謝等過程，有望成為評價軟骨細胞的新指標，對軟骨細胞檢測和新生軟骨評價有積極意義，在軟骨細胞治療和軟骨組織工程中有著較為廣闊的應(yīng)用前景。

2 PCM在力學信號轉(zhuǎn)導中的作用

PCM具有機械傳感特性，能夠調(diào)節(jié)細胞外基質(zhì)傳輸?shù)牧W信號[3]，完成力學-生化信號轉(zhuǎn)導。功能上，PCM獨特的結(jié)構(gòu)和功能顯著影響軟骨細胞的微機械環(huán)境，PCM作為生物信號和力學信號的過濾器和傳感器，在組成軟骨細胞-基質(zhì)力學信號轉(zhuǎn)導中發(fā)揮重要作用[18]。

2.1結(jié)構(gòu)基礎(chǔ) PCM中的Ⅵ型膠原和蛋白聚糖構(gòu)成多孔多滲的空間網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，水分子、離子填充其中。當軟骨組織受到機械壓力時，PCM中的間隙水滲出，引發(fā)蛋白聚糖表觀濃度增加，間隙離子聚集，固定電荷密度和離子濃度瞬時變化，繼而引發(fā)局部滲透性改變，完成力學-生化信號的轉(zhuǎn)導[45]。Hing等[46]研究發(fā)現(xiàn)，利用酶溶法和機械分離兩種方法獲取獨立的軟骨單位，當周圍滲透壓改變時，軟骨單位中軟骨細胞表現(xiàn)出的腫脹反應(yīng)與不含PCM的軟骨細胞不同，提示周圍環(huán)境中的機械化學刺激作用于PCM，通過PCM的調(diào)制引起軟骨細胞應(yīng)答，進而影響軟骨組織的生理病理過程。Khoshgoftar等[47]通過構(gòu)建關(guān)節(jié)軟骨無限加壓的固體-溶質(zhì)-離子三相有限元模型發(fā)現(xiàn)，在關(guān)節(jié)軟骨中存在深度依賴的應(yīng)變場，軟骨細胞剪切應(yīng)力對PCM和局部細胞外基質(zhì)的機械性能敏感；在軟骨機械環(huán)境變化早期，即使沒有宏觀組織性能的結(jié)構(gòu)變化，PCM和局部細胞外基質(zhì)的微觀結(jié)構(gòu)改變也會導致軟骨細胞剪切應(yīng)變增加。與正常軟骨相比，骨關(guān)節(jié)炎的軟骨組織中PCM剛度降低，其標志成分Ⅵ型膠原和基底膜蛋白多糖出現(xiàn)降解，PCM的變化與軟骨細胞空間結(jié)構(gòu)變化保持一致[13]。超微結(jié)構(gòu)水平下，PCM中膠原纖維調(diào)節(jié)軟骨細胞機械微環(huán)境的作用也得到證實，Korhonen和Herzog[48]證實，軟骨細胞體積對膠原纖維的剛度變化高度敏感，其排列趨勢與軟骨細胞的空間位置有關(guān)，提示PCM在軟骨發(fā)育和退變中調(diào)節(jié)機械微環(huán)境的重要作用。

PCM的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)是維持軟骨微環(huán)境、發(fā)揮生物效應(yīng)的前提，PCM與細胞膜和基質(zhì)成分相關(guān)，Ⅵ型膠原和基底膜-蛋白多糖通過對應(yīng)受體錨定于細胞膜表面，同時能夠與PCM中的多糖相連，相互溝通，PCM的完整和穩(wěn)定對發(fā)揮力學作用有重要影響。Xu等[36]在敲除基底膜蛋白多糖基因的Schwartz-Jampel綜合征小鼠模型中通過原子力顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)，胚胎肱骨中軟骨細胞和軟骨組織的剛度下降，提示在軟骨發(fā)育過程中，基底膜蛋白多糖在PCM內(nèi)外機械信號轉(zhuǎn)導和細胞內(nèi)應(yīng)答中發(fā)揮作用，對于正常軟骨力學的維持必不可少。Alexopoulos等[29]在敲除Ⅵ型膠原的小鼠模型中也觀察到類似現(xiàn)象。與之相對應(yīng)的是，從軟骨組織中分離出的獨立的軟骨細胞(不含PCM)在體外三維培養(yǎng)條件下，隨著PCM組裝和基質(zhì)沉積，細胞-PCM整體剛度和表面模量逐漸增加[16,49]。

2.2信號轉(zhuǎn)導 細胞常見的機械刺激受體有細胞表面的整合素、鈣離子通道、原發(fā)性纖毛和非選擇性細胞表面通道[50]等。Ⅵ型膠原、基底膜蛋白多糖等結(jié)合于軟骨細胞表面，通過跨細胞膜表面受體(如整合素和盤狀區(qū)域受體)將機械刺激信號傳至軟骨細胞，引發(fā)胞內(nèi)改變[51]。Zelenski等[52]通過原位測量細胞學行為和基質(zhì)特性發(fā)現(xiàn)，Ⅵ型膠原通過瞬時受體電位香草酸亞型4介導的Ca2+信號參與調(diào)節(jié)細胞外基質(zhì)-PCM-軟骨細胞的機械應(yīng)力及滲透應(yīng)力的傳導和傳遞，其中Ⅵ型膠原未直接參與物理和化學信號轉(zhuǎn)導，而是通過瞬時受體電位香草酸亞型4發(fā)揮作用。

PCM的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)中儲存著多種類型的生長因子和其他調(diào)控分子，作為生長和調(diào)控因子庫，在組織受到機械刺激時釋放出生長或調(diào)控因子參與生物力學信號轉(zhuǎn)導。其中具有代表性的是轉(zhuǎn)化生長因子-β[53]和FGF-2[54]。軟骨組織在受到切割和循環(huán)加壓刺激時，隔離在基底膜蛋白多糖硫酸乙酰肝素鏈上的FGF-2釋放，作用于軟骨細胞[55]。FGF-2通過與軟骨細胞表面不同的FGF受體結(jié)合，發(fā)揮不同的作用，F(xiàn)GF-2促進軟骨分解和抑制軟骨合成的作用主要通過FGF受體1介導，而保護軟骨的作用則通過FGF受體3介導[56-57]。在維持軟骨微環(huán)境的動態(tài)平衡中，不同受體表達和受體阻滯參與信號傳遞過程，產(chǎn)生信號傳遞和生物反應(yīng)多樣。此外，Sun等[35]在研究中發(fā)現(xiàn)，包括FGF-2在內(nèi)的成纖維細胞生長因子家族在PCM中的結(jié)合和擴散受限于PCM中膠原蛋白和蛋白多糖相互作用，PCM復雜的空間結(jié)構(gòu)保證了黏附和受體結(jié)合位點空間分布的獨立性。

PCM中相互作用的高度多樣性為連接細胞-基質(zhì)和細胞-細胞的動態(tài)網(wǎng)絡(luò)奠定了基礎(chǔ)，對局部微環(huán)境的擾動保持敏感。在機械載荷作用下，PCM通過分離和釋放不同的分子、離子調(diào)整PCM結(jié)構(gòu)，將力學信號傳至軟骨細胞。目前，對生物力學信號轉(zhuǎn)導過程中各類信號分子、釋放機制、傳導通路和調(diào)節(jié)機制的研究，能夠部分解釋PCM和軟骨細胞的生物學行為、軟骨疾病的病理生理過程[58]，但仍有許多未知和爭議之處，需繼續(xù)深入研究。隨著PCM在瞬時受體電位香草酸亞型4相關(guān)通路、FGF受體介導的力學傳導過程中的作用逐步揭示，尋找前者的靶向位點以干預軟骨組織的力學性質(zhì)，進而應(yīng)用于軟骨相關(guān)疾病的治療以及構(gòu)建新生軟骨領(lǐng)域等逐漸成為可能。

3 結(jié) 語

PCM獨特的成分和結(jié)構(gòu)使其在維持軟骨細胞微環(huán)境、力學性質(zhì)和細胞-基質(zhì)間力學信號轉(zhuǎn)導中發(fā)揮重要作用，維持機械微環(huán)境的同時，在生化-力學信號的放大、反饋、調(diào)節(jié)等方面起著重要作用。

PCM維持軟骨局部微環(huán)境穩(wěn)態(tài)，對生化-力學信號反應(yīng)敏感，在軟骨相關(guān)疾病早期其已出現(xiàn)成分和力學性質(zhì)的顯著改變，研究PCM有助于早期診斷軟骨相關(guān)疾病。PCM的高親和網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)和生理條件下基質(zhì)組裝、膠原沉積和組織重構(gòu)、仿生學的組織構(gòu)建為軟骨組織工程提供了新思路。調(diào)整外源刺激、調(diào)節(jié)信號分子、選擇性激活信號通路，通過干預軟骨生物-力學信號轉(zhuǎn)導過程獲得可控的生物力學性質(zhì)，在軟骨疾病的治療和軟骨組織工程等領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前景。