高通量測序技術在白血病臨床應用中的研究進展

殷悅，王雅梅

(首都醫科大學 a.2017級臨床醫學“5+3”一體化專業三班,b.基礎醫學院生化與分子生物學系，北京 100069)

白血病是由造血干細胞惡性增殖、分化障礙、凋亡受阻等機制引起的血液系統惡性腫瘤性疾病。近年來，白血病的發病率呈上升趨勢，在我國各種惡性腫瘤致死率中居第六位(男性)和第八位(女性)，在兒童和青少年的惡性腫瘤中居第一位[1-3]。由于白血病的發病機制尚不完全清楚，而其隱匿性、異質性和復雜性[4]，增加了早期診斷的難度，致使一些患者錯過最佳的治療時機；盡管通過放療、化療、骨髓移植以及免疫學療法治療可以提高白血病患者的生存率，但停止治療后由耐藥引起的復發也成為臨床治療的難題[5]。

隨著人類基因組計劃的完成，高通量測序技術的突破性發展推動了精準醫學時代的到來。高通量測序技術為臨床腫瘤學的研究開拓了新思路，提供了解決難題的有效方法[6]。目前，高通量測序技術已被廣泛應用于白血病的臨床研究，在白血病相關突變基因的篩查、尋找新的治療靶點、個性化治療以及預后監測方面均顯示出巨大的優勢[7]?，F主要介紹高通量測序技術在白血病臨床診斷、患者風險分層、治療、預后分析中的應用進展。

1 高通量測序技術概述

1.1高通量測序技術的發展 繼Sanger測序為代表的第一代測序技術問世以來，基因測序技術不斷發展。2005年，隨著瑞士Roche公司的焦磷酸測序技術、美國Illumina公司的Solexa和美國ABI的SOLiD等測序平臺的出現，標志著第二代測序技術即高通量測序時代的到來。此后，高通量測序技術進一步發展，出現并行單分子合成測序技術、單分子實時合成測序技術、納米孔單分子測序技術、基于熒光共振能量傳遞的測序技術等第三代測序技術[8]。目前，高通量測序技術可以同時對幾百萬甚至數億條DNA序列進行測序[9]。第三代測序技術彌補了第二代測序技術的缺陷，具有通量更高、測序時間更短、數據讀取速度更快的特點，可提高測序的精確度、降低測序反應的成本，真正實現了單分子測序，已經成為醫學研究的重要技術手段。

1.2高通量測序技術的應用 高通量測序技術以大數據、多維度的研究模式提高了醫學研究的效率，改變了人們對疾病的認識。全基因組、轉錄組及表觀遺傳組學的高通量測序分析在揭示腫瘤異質性、追蹤細胞譜系、探索腫瘤克隆演變的復雜機制研究中發揮重要作用[10]。在白血病的臨床檢測中，國際指南已將越來越多的基因突變列為預后指標，建議利用高通量測序技術篩查多基因突變進行預后評估[11]。高通量測序技術與經典細胞遺傳學技術的有效融合使人類對白血病的生物學、遺傳學基礎有了更深入的了解[12]。

2 高通量測序技術在白血病臨床研究中的應用

2.1在白血病診斷中的應用 白血病是造血干細胞異?？寺⌒约膊。哂懈叨鹊漠愘|性，受外界環境因素影響，血液腫瘤細胞會發生動態的基因突變和克隆演變。這種復雜的基因改變是傳統技術無法全面檢測的，而高通量測序技術可一次檢測多種基因變異，有效識別亞克隆，且靈敏度更高，在探索白血病基因突變、腫瘤克隆演變的復雜機制研究中發揮重要作用。

2.1.1混合譜系白血病的診斷 混合譜系白血病是一類惡性程度高、預后差、治療難度大的急性白血病，因具有獨特的臨床和生物學特征而引起廣泛關注?；旌献V系白血病以基因重排為特征，常規的臨床診斷方法包括細胞遺傳學和熒光原位雜交，在許多患者中無法檢測到混合譜系白血病易位伴侶基因。長距離反向聚合酶鏈反應(polymerase chain reaction,PCR)是混合譜系白血病臨床診斷的“金標準”。但長距離反向PCR技術受DNA酶解程度、酶解片段自身環化效率的制約，環化易產生多聯體且需要大量的基因組DNA樣本。為了克服該技術的局限性，研究人員采用高通量測序的方法，只需要微量RNA樣本，結合錨定復合PCR富集快速識別患者標本中廣泛的混合譜系白血病融合，采用美國Illumina公司Archer FusionPlex Heme(血紅素)和Myeloid(髓樣)試劑盒制備的文庫，在Illumina平臺進行測序。與長距離反向-PCR相比，Archer FusionPlex錨定復合PCR富集高通量測序方法是檢測混合譜系白血病基因重排的相對簡單而有效的技術[13]。因此，對于混合譜系白血病的臨床診斷，Archer FusionPlex錨定復合PCR富集高通量測序有望成為新的技術標準。

2.1.2急性髓細胞性白血病(acute myelogenous leukemia,AML)的診斷 全基因組重測序使得大量臨床相關基因可以在一個單一的試驗中同時進行評估，快速、經濟、有效地識別特定疾病人群的相關突變，在突變基因多和突變譜廣的情況下更為有效[14]。急性白血病的突變譜能夠鑒別具有診斷預后預測和治療作用的遺傳突變。研究表明，Ion Torrent PGMTM測序可以快速、簡便地獲得AML患者的基因突變譜，明確患者的基因型診斷，為AML進一步分層診療、制訂治療方案提供依據[15]。

田淼等[16]報道了利用高通量微RNA(microRNA，miRNA)測序技術分析AML血漿外泌體miRNA，作為疾病監測的標志物來替代傳統骨髓穿刺活檢的研究。該研究采用Solexa高通量測序技術，分析了AML患者和正常人血漿外泌體miRNA的表達，獲得了211個顯著差異表達的miRNA。該結果與Hornick等[17]在小鼠模型中的研究結果一致。其中，血漿外泌體miR-155-5p、miR-335-5p、miR-451a有望作為AML早期診斷的分子標志物，證實了高通量測序技術在癌癥早期診斷中的潛力。

高通量測序技術可以改進和細分AML的遺傳學診斷，除了現有的世界衛生組織(World Health Organization,WHO)亞型，利用高通量測序的分析發現了AML的3個基因組類別：染色質-剪接體、TP53基因-非整倍性以及IDH2R172基因突變[18]。

2.1.3兒童急性淋巴細胞白血病(acute lymphoblastic leukemia,ALL)的診斷 兒童ALL的臨床遺傳學診斷通常使用核型分析(G帶)和熒光原位雜交，但是遺傳學技術不能捕獲癌癥基因組中復雜像差的全部光譜。Nordlund等[19]采用全基因組鏈讀測序技術分析了12例ALL基因組，高精度地解析出由細胞遺傳學定義的大多數基因組畸變，甚至在其中10例鑒定出遺傳學方法未能檢出的結構重排，但DUX4-IGH融合基因未能檢出。全基因組鏈讀測序技術在ALL診斷方面可以作為傳統遺傳學技術的補充，有助于提高ALL遺傳學診斷的精準度。

2.2在白血病患者風險分層中的應用 隨著白血病研究的不斷深入，患者在確診后還需要進行各種預后指標的全面檢查，根據不同的指標對患者進行風險預測和分層，然后制訂合理的個性化治療方案，目的是減少低?；颊叩闹委煻拘裕垢呶；颊叩玫接行е委?。染色體和各種基因變異是進行風險分層的重要指標，高通量測序技術的應用提高了患者風險分層的準確性。

2.2.1ALL風險分層 RNA測序技術和全基因組測序技術可以檢測基因的結構變化和序列改變，細化ALL的亞型分類和風險預測。ALL中有一種高危亞型被稱為費城染色體樣(Philadelphia chromosome like,Ph-like)ALL。2016年，Ph-like ALL作為一種暫定亞型被納入WHO急性白血病分類，作為一種獨立的亞型存在。隨著基因組高通量測序技術的進步，更多與Ph-like ALL高危特點及預后不良有關的基因組改變被不斷發現。目前，Ph-like ALL的臨床試驗正在檢測靶向性治療方法的可行性，研究人員預測高通量測序技術將開拓新穎精確的治療方案，包括脫細胞技術、以基因變異為導向的殘留病灶的監測等[20]。

2.2.2AML風險分層 基于高通量測序的多基因檢測在AML的風險分層中也發揮了重要作用。日本科學家選取369例初生兒科AML患者中的139例進行了轉錄組分析(RNA測序)，在53例患者中鑒定出54個框內基因融合和1個Runt相關轉錄因子1(Runt-related transcription factor 1，RUNX1)基因框外融合。RNA測序結果揭示了兒童AML中基因重排和突變的復雜性，顯示了兒童AML患者和成人AML患者不同的實體特征，因此應重新考慮風險分層，為兒童AML患者臨床治療方案的制訂提供依據[21]。

傳統的細胞遺傳學將AML患者分為良好、中度和不良風險組。然而在包含了大部分患者的中等風險組中，患者治療結果卻各不相同。Lin等[22]的研究利用高通量測序技術分析了112例接受標準治療的AML患者中的260個基因，從中找到了與預后相關的獨立突變基因。在中等風險細胞遺傳學的患者中，CCAAT/增強子結合蛋白α基因雙突變，異檸檬酸脫氫酶2和核仁磷酸蛋白1基因突變且缺乏FMS樣酪氨酸激酶3基因內部串聯重復基因的患者更接近于具有良好風險細胞遺傳學的患者。甲基胞嘧啶雙加氧酶2、RUNX1、ASXL1和DNA甲基轉移酶3A基因突變的患者，則類似于具有不良細胞遺傳學風險的患者。在此基礎上對患者重新分類，顯著減少了被分類為中度風險的患者數量。此項研究表明，基于高通量測序的多基因測序在臨床上可用于建立指導治療決策的準確風險分層系統。

應用高通量測序技術建立大量AML患者基因圖譜的數據庫，為AML的風險分層等多種研究提供了有力支持。在癌癥基因組圖譜(The Cancer Genome Atlas,TCGA)計劃的一項研究中，應用高通量測序技術對200例AML患者進行全基因組(50例)或全外顯子組測序(150例)，對RNA和miRNA的表達進行分析，得到了突變譜分析數據[23]。Gerstung等[24]設計了可以準確預測緩解率、復發率和死亡率的多階段統計模型，并在單獨的TCGA患者數據集合上成功驗證。在模擬中，總生存率不變的情況下，基于新算法的精確風險分層能夠將同種異體造血細胞移植術的數量減少多達25%。

2.3在白血病治療中的應用 高通量測序是分析髓樣腫瘤基因變異頻譜的有力工具，再與靶向治療和基因組生物標志物相結合，為許多患者的精準醫療創造了條件[25-26]。傳統技術對于基因變異無法深入研究，因而對很多特殊、罕見的病例，高通量測序技術可以彌補傳統技術的缺點。

2.3.1侵襲性自然殺傷細胞(natural killer cell，NK細胞)白血病的治療 隨著高通量測序技術的發展，多基因聯合檢測可以更好地進行疾病發病機制的研究，基于高通量測序的突變分析的優勢更加明顯[27-28]。侵襲性NK細胞白血病(aggressive natural killer cell leukemia，ANKL)是NK細胞腫瘤的一種罕見形式，大多數患者短期內出現多器官功能衰竭，甚至在接受及時治療后數天至數月內死亡，且常規的化療并不起作用[29-30]。Huang等[31]通過結合全基因組、轉錄組和靶向測序以及細胞因子芯片對ANKL的發病機制進行了全面研究，先從8例新發ANKL患者的血液中分選帶有CD25+CD3-標記的NK細胞、受損的正常粒細胞進行全基因組測序，以尋找與ANKL相關的功能序列。研究人員采用美國Illumina公司的Ampli-Seq對29例ANKL患者的血漿樣本進行靶向測序，在48%(14/29)的ANKL患者中發現了Janus激酶-信號轉導及轉錄激活因子(Janus kinase-signal transduction and activator of transcription，JAK-STAT)途徑的突變。轉錄組測序的結果表明STAT3激活和MYC表達對于ANKL細胞的增殖和存活至關重要。進一步研究發現，白細胞介素(interleukin,IL)-10可以刺激STAT3的磷酸化，從而使癌細胞增殖，STAT3磷酸化抑制劑(Stattic)和MYC抑制劑(JQ1)可以抑制癌細胞增殖。該研究利用高通量測序技術，鑒定并在功能上驗證了參與ANKL發病機制的IL-10/JAK-STAT/MYC信號轉導通路，為開發治療這種亞型白血病的新藥提供了有力的支持。

2.3.2混合表型急性白血病的治療 應用高通量測序技術分析混合表型急性白血病致病基因潛在的調控位點，可為靶向治療提供依據。Granja等[32]通過單細胞RNA測序技術和單細胞ATAC測序技術聯合分析，使用健康人的外周血和骨髓單個核細胞構建造血發育的免疫表型、轉錄組和表觀單細胞圖譜，再將混合表型急性白血病患者的單細胞數據進行比對。結果發現，轉錄因子RUNX1可能潛在調控混合表型急性白血病患者惡性致癌基因，針對RUNX1抑制劑的研究將為治療混合表型急性白血病的藥物研發提供新思路。Hou等[33]利用高通量測序技術對原發性血小板增多癥患者進行單細胞全外顯子測序發現了與原發性血小板增多癥發病機制相關基因SESN2、NTRK1基因。關鍵基因的發現可以作為新的靶點，為新藥物的研發奠定基礎。

2.3.3AML的治療 通過高通量測序技術篩選出的AML相關突變基因包括核仁磷酸蛋白1、CCAAT/增強子結合蛋白α、RUNX1、FMS樣酪氨酸激酶3、TP53、ASXL1等[34]。目前，已被作為治療靶點列入白血病治療指南中。應用這些靶點研發的分子靶向治療藥物有望提高AML患者的療效。如針對AML患者中FMS樣酪氨酸激酶3突變的抑制劑米朵妥林，異檸檬酸脫氫酶2突變選擇性抑制劑Enasidenib等[35]。Fu等[36]利用TCGA數據，結合德國AML合作組織提供的AML患者的臨床和生存信息數據，通過生物信息學分析在全基因組范圍內篩選出了與預后相關的標志基因FHL1基因，實驗證實FHL1高表達不利于AML化療和骨髓移植的預后及患者的生存，因此FHL1有望成為新的治療靶點。高通量測序技術為AML患者的精準治療提供了技術保障，逐漸推動AML由化療治療轉為靶向治療[36]，而精準的靶向治療還有利于改善患者的預后[37]。

2.4在白血病預后分析中的應用 微小殘留病(minimal residual disease,MRD)是指經治療后患者體內仍存在惡性細胞，是ALL中最重要的獨立預后因素。使用高通量測序技術可以檢測治療后ALL患者體內是否存在MRD，從而可以預測并采取措施預防白血病的復發。研究顯示，使用高通量測序檢測兒童ALL患者體內球蛋白重鏈基因和互補決定區3基因，有助于分析白血病的分支演變模式；同時通過檢測MRD，協助判斷ALL患者復發的可能性[38]。目前公認ALL的MRD分析金標準是利用等位基因特異性引物對克隆免疫球蛋白和T細胞受體基因重排進行實時定量PCR。研究顯示，高通量測序在預測復發方面的靈敏度高于實時定量PCR[39]；此外，高通量測序還可以提供有關治療期間和治療后生理性B細胞和T細胞庫的信息，這些信息已顯示出與預后相關。因此，高通量測序在預測白血病的復發方面有巨大的潛力且有望成為新的金標準。

在白血病的預后分析中，基因突變也是不容忽視的因素。特定基因突變與疾病的不良預后相關，如FBXW7基因[40]、IL-7R[41]、JAK1[42]。隨著高通量測序技術的發展，越來越多與白血病預后不良的基因突變被檢出。目前WHO等權威的臨床指南已將基因突變引入惡性血液腫瘤的危險度預后分層和細化分類中，臨床相關的基因在指南更新中所占比例逐年增加。WHO對于髓樣腫瘤和AML的最新更新中包括了兩個新的分類：RUNX1突變的AML和BCR-ABL1基因的AML，且2017年歐洲白血病網關于AML的建議風險分層中新增了RUNX1、ASXL1和TP53的基因突變[37]。因此，結合高通量測序技術的基因水平綜合評估和最小殘留疾病的評估有望進一步改善風險分層和白血病的預后。

3 展 望

高通量測序技術已被廣泛應用于白血病的臨床研究，在白血病相關突變基因的篩查、尋找新的治療靶點、個性化治療以及預后監測方面均顯示出巨大優勢，但仍面臨許多困難和挑戰。高通量測序技術測定的致病基因靶點，需要進行大量驗證以區分白血病基因變異的共性和異質性，排除干擾因素。高通量測序技術應用于臨床診斷仍缺少規范的操作指南和數據解讀標準，不同的實驗室測序方法、平臺、閱讀深度和變異分析可能不同。此外，通過高通量測序技術測定的標志物目前還無法取代大多數的形態學檢查，需要大量的臨床研究制訂相關標準。為規范高通量測序技術在血液腫瘤診療中的應用，中國抗癌協會血液腫瘤專業委員會聯合多家權威機構和專家共同制訂了《二代測序技術在血液腫瘤中的應用中國專家共識(2018年版)》[43]，該共識的制訂對高通量測序技術在血液腫瘤中的臨床應用起到規范化的作用，為提高我國血液腫瘤的診療水平發揮重要作用。

美國國立癌癥研究院提出的精準醫學概念是將個體疾病的遺傳學信息用于指導其診斷和治療的醫學。隨著高通量測序技術的發展，未來人們利用單分子測序技術可以建立個人基因組的信息檔案[44]，人類對疾病的認識更加微觀，從基因的層面尋找治療靶點，實現精準醫療。高通量測序技術在白血病臨床診斷、治療、預后以及新藥研發方面的應用中已經展示了巨大的潛力，對白血病的分類細化甚至為罕見病的治療帶來希望。目前，高通量測序技術還在飛速發展，其潛力有待進一步發掘。可以預見，隨著與發病機制相關的突變基因、細胞信號通路和靶點的不斷發現，白血病有望早日實現精準醫療。