肝癌免疫治療聯合放射治療進展

劉佳妮 徐西偉 鄧云 陳少億 張可

一、肝癌治療背景及現狀介紹

肝癌是男性癌癥死亡的第二大原因，在全球男女癌癥死亡率中高居第四位。肝癌中肝細胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）占75%～85%，其發病原因主要為肝炎病毒感染、酗酒和肥胖等[1]。慢性肝炎發展至肝硬化從而導致門脈高壓的發生，進一步創造了利于腫瘤生長的低氧環境[2]，其還能通過減少先天免疫蛋白和模式識別受體（pattern recognition receptor，PRR）的合成來損害肝臟內的免疫監視，反過來破壞肝臟巨噬細胞（Kupffer cell）和竇狀內皮細胞的抗原呈遞和吞噬能力，從而在患者體內形成免疫缺陷環境，并促進肝癌的發生[3]。

早期HCC的根治性治療包括手術切除或肝移植，預期5年生存率在60%～80%。但是，只有不到20%的HCC患者能接受這些治療。無法接受根治性治療的患者建議局部治療，例如射頻消融、化學療法或放射栓塞術，以控制疾病局部進展[4]。對于不可切除的晚期HCC，推薦使用全身治療，如酪氨酸激酶抑制劑（tyrosine kinase inhibitor，TKI），該類藥物有索拉非尼等。樂伐替尼（Lenvatinib）是晚期HCC的另一種一線治療選擇，與索拉非尼相比，在中位總生存期（overall survival，OS）方面差異不大，但無進展生存期（progression-free survival，PFS）和客觀緩解率（objective response rate，ORR）有優勢。瑞戈非尼、卡博替尼和雷莫蘆單抗是疾病進展的晚期HCC患者的二線治療方案[9]。近年來，免疫檢查點阻斷（immune checkpoint blockade，ICB）已成為晚期肝癌患者的希望[5]。在晚期HCC中使用抗程序性細胞死亡蛋白1（programmed death-1，PD-1）抗體的Ⅱ期和Ⅲ期ICB試驗均已證明具有臨床益處，并且發生與治療相關的嚴重不良事件的發生率較低[6]。在2020年3月FDA批準將伊匹單抗（ipilimumab） （抗CTLA-4）與納武單抗（nivolumab） （抗PD-1）聯合用于索拉非尼患者。除了多種ICB的組合外，越來越多的證據表明放療在增強腫瘤免疫力中起著重要作用。如臨床前研究表明放射治療(radiotherapy，RT)和ICB的組合可以協同增強兩種治療方案誘導的抗腫瘤反應[7]。在本綜述中，我們將討論RT和ICB對腫瘤微環境(tumor microenvironment，TME)的影響，以及這種聯合療法如何協同控制HCC進展。

二、HCC的免疫微環境和免疫治療

慢性肝炎感染或長期肝損傷常常使肝臟處于慢性炎癥狀態。適度的炎癥可提供針對病原體的保護作用，并修復組織損傷，然而，持續的肝臟炎癥會擾亂微環境從而促進癌變。如肝臟中分泌的細胞因子和趨化因子可以促進血管生成、免疫逃逸和抗凋亡反應，并募集具有創造促進腫瘤生長的微環境能力的免疫細胞[8]。與鄰近的非腫瘤或健康肝臟組織相比，抗炎細胞因子白介素10（interleukin-10，IL-10）已被證明在HCC腫瘤組織中高度富集。高水平的轉化生長因子β（transforming growth factor-β，TGF-β）也與晚期HCC的腫瘤侵襲性增加相關[9]。腫瘤相關的細胞因子和趨化因子能夠募集并使免疫亞群極化并分化為促腫瘤表型，從而促進腫瘤發生。此類免疫亞型之一是腫瘤相關的巨噬細胞（tumor-associated macrophage，TAM），可通過TME中存在的IL-10，TGF-β，IL-4或IL-13極化為M2巨噬細胞表型，并通過支持血管生成來驅動腫瘤進展和募集調節T細胞（regulatory cells，Tregs）[10]。TAM在腫瘤區域的積累通常與包括HCC在內的多種癌癥類型的預后不良相關。此外，調節或抑制CD8（+）T細胞活化和細胞毒性能力的Treg在促進腫瘤發生中也起著關鍵作用。另外，IL-17也和HCC患者的較差預后相關[11]。HCC中富含TGF-β的TME有助于輔助性T細胞17（T helper cell 17，Th17）的分化，Th17是產生IL-17的白細胞分化抗原4陽性（cluster of Differentiation，CD4） （+）輔助T細胞亞群。Th17在腫瘤內的富集與HCC患者的微血管浸潤以及較差預后呈正相關[12]。另一方面，能夠產生γ干擾素（interferon γ，IFN-γ）的CD4（+）T輔助細胞1（Th1）可以激活樹突狀細胞，從而促進CD8（+）T細胞的啟動和成熟。Th1還可以通過干擾素依賴性機制觸發樹突狀細胞（dendritic cell，DC）介導的腫瘤殺傷作用，并進一步增強下游的抗腫瘤免疫反應[13]。經肝動脈化療栓塞治療后，HCC患者的Th1反應增強，其與預后良好相關[14]。盡管Th1具有抗腫瘤能力，但與正常健康肝臟相比，研究發現2型CD4（+）T輔助細胞（Th2）在HCC組織中富集，并且與HCC患者的總生存率呈負相關。Th2細胞因子，例如IL-4、IL-10以及IL-13能夠誘導M2型巨噬細胞，M2型巨噬細胞具有抑制CD8（+）T細胞介導的抗腫瘤活性作用[15]。Th2細胞因子的上調和丙型肝炎病毒誘發的HCC的可能性增加相關。CD8（+）組織駐留記憶T細胞（tissue- resident memory，Trm）、CD8（+） 效 應 記 憶T細 胞（effector memory，Tem）和自然殺傷（natural killer cell，NK）細胞等細胞毒性免疫細胞在抗腫瘤免疫中也起著關鍵作用。然而有報道指出與來源于非腫瘤區域的NK細胞相比，在HCC的腫瘤區域內發現的NK細胞顯示出較差的細胞溶解能力和較少的IFN-γ的產生[16]。盡管Trm和Tem細胞的存在與HCC的預后良好相關，但它們經常表達諸如PD-1、淋巴細胞激活基因 3（lymphocyte activation gene 3，LAG-3）和細胞毒性T淋巴細胞相關抗原4（cytotoxic T lymphocyte associated antigen-4，CTLA-4）之類的免疫耗竭標志物，這些標志物與其功能呈負相關[17]。因此，這些耗竭標志物已成為ICB激活和恢復CD8（+）T細胞功能的主要靶點[28]。

免疫療法在HCC的獲益在幾篇綜述[18-19]中進行了大量討論。特別是在ICB，針對PD-1、PD-L1和CTLA-4的抑制劑也在HCC的臨床試驗中進行了大規模驗證。腫瘤細胞上PD-L1表達的上調，特別是其與腫瘤浸潤性活化T細胞表達的PD-1結合后，能誘導耗竭并抑制這些效應細胞的抗腫瘤免疫活性，從而允許腫瘤細胞的免疫逃避。抑制PD-1/PD-L1相互作用可以逆轉這些細胞毒性免疫細胞的耗竭狀態，并恢復其抗腫瘤活性[20]。在兩項臨床試驗中，ICB在晚期HCC的臨床益處是顯著的，總體有效率更高[23]。另一種備受關注的ICB是CTLA-4，與PD-1/PD-L1途徑不同，CTLA-4主要在T細胞啟動階段向上游作用，并因此具有更多的不良事件。臨床前和臨床研究都表明，抗CTLA-4的給藥通過減輕Tregs的免疫抑制作用直接誘導CD4（+）和CD8（+）效應T細胞[21]。最近FDA批準了ipilimumab（抗CTLA-4）和nivolumab（抗PD-1）用于既往接受過索拉非尼治療進展的晚期HCC患者[14]。盡管觀察到ICB療法在廣泛的腫瘤中取得了初步的成功，但在經歷了ICB治療的初始反應后其療效有所下降并且出現了獲得性耐藥的現象，已有研究對HCC患者這種變化的反應率進行了深入的研究[22]。

三、HCC的放射治療進展

既往的HCC放療因為全肝照射的耐受劑量有限，而無法達到腫瘤部位理想的放療劑量[23]。隨著放療技術的進步，能夠實現腫瘤部位的高劑量輻射的同時，限制對周圍正常組織的損害，如體部立體定向放射治療（stereotactic body radiation therapy，SBRT）和放射栓塞（radioembolization，RE）技術。由于定位成像、放療計劃和傳輸系統技術的進步，SBRT能夠在較少的放療次數下達到較大分割的外照射劑量[9]。相比之下，放射性內照射是一種內部放射技術，主要利用β射線，通過肝動脈將放射性標記（如Y90）的微栓塞顆粒直接引入HCC，從而限制組織穿透范圍。這些進展擴大了HCC治療的放射治療應用范圍[7]。SBRT被證明有著良好的腫瘤控制率，兩年局部控制率在84%～95%。然而，其總體生存率受到肝內照射野外以及其他部位的腫瘤進展的限制[24]，這突出了同時進行系統性疾病控制的必要性。SBRT因放療技術的進步，能夠對正常組織進行保護使其顯示出良好的耐受性。由于其總體療效和安全性，這些放射療法現在已被更廣泛地用于腫瘤的局部控制和過渡/降期治療中，以利于后續根治性治療的進行，如移植或切除[25]。傳統上，放療治療癌癥的基本原理是用高能粒子誘導腫瘤細胞致命的DNA損傷，導致隨后的細胞死亡。另外，在對腫瘤靶病灶進行電離輻射治療后，非治療部位的遠位腫瘤也有縮小，這種放射治療引發免疫介導的抗腫瘤反應能力的現象被稱為“遠位效應”，這種現象在最近10年越來越受到關注。RT引起免疫原性細胞死亡和細胞應激，增加了腫瘤相關抗原暴露和促進損傷相關分子模式（damage associated molecular patterns，DAMPs），反過來亦能激活樹突狀細胞。一種專業的抗原呈遞細胞，可激活腫瘤特異性CD8（+）T細胞，進一步增強抗腫瘤反應，促進免疫細胞滲透到TME[26]。研究表明，在HCC經歷SBRT、Y-90-RE后，不同腫瘤類型的抗原呈遞活性有所增加。例如PRRs在識別DAMPs后，會激活干擾素基因（stimulator of interferon genes，STING）通路的刺激因子，介導激活下游免疫反應的I型干擾素(IFN-α和IFN-β)的產生[27]。臨床前和臨床研究均報告了輻射誘導免疫反應的進一步證據，觀察到了抗腫瘤免疫亞群如CD4（+）、CD8（+）T細胞、NK和NKT向TME的激活和募集增加的現象。總之，這些發現與RT可以將免疫原性低、免疫細胞浸潤少的“冷”腫瘤轉化為免疫反應性“熱”腫瘤的觀點一致，后者被證明免疫細胞浸潤良好。盡管最初有免疫激活現象，但RT可以間接導致隨后的免疫抑制效應，如后續招募Tregs和TAMs到TME。輻射誘導的干擾素活性也可引起腫瘤浸潤細胞毒性T細胞耗竭分子或信號通路的上調[28]。研究表明，在HCC患者中用Y-90-RE治療后，CD8（+）T細胞耗竭增加，表現為T細胞免疫球蛋白黏蛋白3（T-cell immunoglobulin mucin 3，Tim-3）和PD-1的表達。其他研究也觀察到，放療可導致腫瘤細胞上調PD-L1表達，這可以減弱抗腫瘤反應[29]。免疫抑制反應壓制了抗腫瘤免疫反應，腫瘤細胞破壞免疫監視，并最終導致放療抵抗。因此，免疫治療的聯用對規避這種放療抵抗和提高放療的臨床獲益是非常必要的。

四、RT和ICB聯合治療

將放射治療和免疫治療結合基于以下原理：放射線增加了抗原的暴露，可以激活免疫系統，并產生協同的抗腫瘤免疫力來持久地控制腫瘤。其中鈣結合蛋白鈣網蛋白的存在是促進吞噬作用的關鍵信號，輻射能促進鈣網蛋白從內質網向質膜的轉運。同時，觸發抗吞噬信號CD47的蛋白可能會在放射線照射后下調[30]。暴露于X射線輻射后，腫瘤細胞能釋放出調節免疫應答激活的另一個關鍵因素，即高遷移率族蛋白B1[31]。另外輻射還能激活環鳥苷酸-腺苷酸合成酶（cyclic GMP-AMP synthase，cGAS）-STING途徑來觸發免疫反應[32]，總之，輻射起著增強抗原呈遞細胞清除受損腫瘤細胞的作用，從而促進了T細胞的啟動。輻射引起的DNA損傷可能會產生新抗原并觸發免疫監視，RT增強了細胞毒性免疫細胞的炎性免疫反應和腫瘤內浸潤，而ICB可以克服CD8（+）T細胞中輻射誘導的耗竭，并恢復其抗腫瘤免疫反應。

研究證實了各種HCC細胞系照射后PD-L1的表達呈劑量依賴性上調，這主要是通過IFN-γ-STAT3信號通路介導的[18]。同樣，臨床研究也報道了CD8（+）T細胞和腫瘤細胞分別在RT后PD-1和PD-L1表達的上調[33]。這些研究為RT與ICB的結合提供了合理的依據，并被視為HCC治療成功的關鍵策略。臨床前數據表明，RT與ICB的結合表現出協同治療作用并有著出色的腫瘤控制率。在用單次10Gy RT和抗PD-L1治療的HCC小鼠中觀察到了顯著的腫瘤生長受抑制和OS的改善[18]。與單一療法相比，在乳腺癌小鼠異種移植模型中同時進行抗PD-L1和12Gy的RT發揮了較好的腫瘤控制作用[16]。在分次放療（2Gy×5）和抗PD-1聯合治療的CT26鼠結腸癌異種移植瘤模型中也觀察到了類似的現象。RT和抗CTLA-4之間的協同作用也已在幾種鼠類腫瘤模型中得到證實。更重要的是，正如依賴于CD8（+）T細胞的腫瘤免疫再激發排斥反應所顯示的那樣，這些效應是持久的。盡管有令人鼓舞的臨床前發現，但我們尚無關于肝癌放療和ICB聯合治療的公開發表的前瞻性臨床數據。Chiang等報道了5例不可切除的大型HCC的患者中，進行了SBRT后續使用nivolumab免疫治療有著100%的ORR[34]。評估ipilimumab治療肝/肺SBRT的I期臨床試驗報告顯示，有23%的患者取得了臨床獲益，且和外周血CD8（+）T細胞數目以及CD8（+）/CD4（+）的比例增加有關[35]。目前正在進行其他一些前瞻性臨床試驗，以評估RT和HCC免疫療法的結合方法。該領域尚處于初期階段，其中大多數研究表明，在接受RT和ICB聯合治療的患者中，其療效和可耐受的毒性特征是令人樂觀的，但并未指定最佳的RT劑量、分割方案和RT/ICB治療順序。這些治療模式的確定主要取決于腫瘤類型和突變負荷[36]。此外，大劑量少分割比常規分割放療更受青睞，使用8-10Gy劑量的放療來似乎能更好地誘發抗腫瘤遠位效應[37]。

五、聯合治療的未來展望

研究顯示在RT之前使用抗血管生成劑，這可以使腫瘤脈管系統“正常化”，從而可能有更好的放療療效[38]。聯合治療后可給予ICB，以進一步維持抗腫瘤免疫力。除了目前在HCC中已被廣泛評估的免疫檢查點抑制劑外，亦有其他新型靶標如吲哚胺 2，3 雙加氧酶（Indoleamine-2，3-Dioxygenase，IDO）。IDO是一種參與免疫穩態的酶，可以使腫瘤細胞逃避免疫監視。IDO在HCC腫瘤中的過表達與預后不良有關，樹突狀細胞通過IDO抑制T細胞并促進HCC的進展[39]。用Lewis小鼠模型進行的臨床前研究表明，用IDO抑制劑和RT進行治療可協同降低Treg以及下調樹突狀細胞和T細胞表達PD-1、PD-L1和TIM-3等免疫抑制因子[40]。亦有一些研究顯示IDO也具有抗腫瘤特性，因此IDO與RT聯合治療HCC的潛力尚待確定。目前，其他幾種B7家族配體，例如B7-H2和B7-H3在其他腫瘤類型被用作的新型免疫治療靶標，在HCC中，B7-H2和B7-H3的獨立或聯合表達都與患者的復發和較差的生存率相關[41]，其在未來可能成為治療HCC有希望的聯合劑。嵌合抗原受體T（chimeric antigen receptors-modified T，CAR-T）細胞療法在淋巴瘤患者和具有可被用作特異性靶標基因驅動突變的實體瘤中顯示出良好療效[42]。然而，HCC是一種在轉錄組上異質性很大的實體瘤，以磷脂酰肌醇蛋白多糖-3（Glypican-3，GPC3）為例，其在成人肝臟不表達, 于肝癌發生時常常再激活。它參與細胞分裂和生長的調控，與HCC的不良預后有關[43]。一項最近結束的I期臨床試驗的結果對GPC3 CAR-T細胞療法在HCC患者中的安全性進行了調查，結果表明該藥具有良好的耐受性并顯示出抗腫瘤活性作用。對于實體瘤，CAR-T細胞療法的安全性和有效性是令人樂觀的，并且作為未來惡性腫瘤新型免疫療法，其發展前景令人期待[44]。另外，外周免疫表型可作為SBRT以及SBRT和ICB聯合治療的療效預測。放射敏感性指數和放射敏感性基因的使用也已被大量研究，但它們的使用價值卻有限[45]。考慮到RT治療后周圍脈管的放射敏感性、毒性和免疫原性特征，優化聯合RT和ICB的方案亦值得進一步探討。因此，需要進一步研究在放療后TME中關鍵免疫檢查點分子的變化，通過研究這些分子的改變及其在后續腫瘤免疫中的作用，以確定需要使用的ICB類型和RT聯合ICB治療劑量和順序。總而言之，目前對于肝癌的各種治療缺乏可靠的預測性生物標志物，這表明在該領域需要投入更大的努力，以便更準確地選擇對患者提供最大臨床獲益和最小副作用的治療方法。

六、總結

肝癌微環境中免疫抑制作用已被能促進腫瘤發生并被耗竭的免疫細胞所證明，這使ICB成為肝癌患者充滿希望的治療選擇。在過去的20年中，放療技術的進步提高了HCC中RT的療效。通過聯合治療，ICB可以克服RT誘導的免疫檢查點分子/通路的上調并恢復抗腫瘤免疫力。反過來，RT還可以將原本“冷”的TME重塑為具有免疫反應性的“熱”TME，從而協同提高ICB的有效性。除RT和ICB之外，還可以探索抗血管生成劑的聯用，其可促進腫瘤血管的正常化并誘發TME中的局部免疫效應。近年來，可供聯合免疫治療選擇的種類迅速增加，因此需要發現更多的預測性生物標志物，以便確定最合適的治療策略并取得最佳的臨床獲益。