血小板微粒表面CD62p在缺血性腦卒中中的檢測價值

胡志清，趙星鵬，劉坦

(鄭州大學附屬洛陽中心醫院 a.檢驗科；b.科研科，河南 洛陽 471009)

卒中是世界范圍內引起殘疾的第三大原因，其中缺血性腦卒中約占所有卒中的87%[1]。缺血性腦卒中指大腦供血動脈閉塞或狹窄使腦供血不足而導致的腦組織不同程度受損，主要由動脈粥樣硬化及繼發血栓形成引起，而血小板在血栓形成過程中發揮著重要作用，而高血壓史、血脂異常、糖尿病、吸煙、超重或肥胖等被認為是缺血性腦卒中的危險因素[2]。近年來，國內外學者深入研究了腦卒中的發病機制，如炎癥反應、血液流變學、鈣超載、細胞凋亡、谷氨酸的興奮毒性等學說。近期研究表明，急性腦缺血后，表達CD62、CD63和血小板反應蛋白的血小板數目增多，在腦缺血的恢復期，仍可觀察到血小板的活化現象[3]。本研究通過檢測缺血性腦卒中患者、腦卒中高危因素人群和健康對照人群體內血小板微粒(platelet microparticles，PMPs)表面CD62p水平，探討其在腦卒中診斷和風險評估中的應用價值。

1 資料與方法

1.1 一般資料選取2019年8月至2020年8月鄭州大學附屬洛陽中心醫院收治的30例缺血性腦卒中患者作為缺血性腦卒中組，30例具有卒中高危因素患者作為高危因素組，另選同期在鄭州大學附屬洛陽中心醫院體檢的30例正常者作為對照組。缺血性腦卒中組年齡40～75歲，平均(65.73±10.16)歲；高危因素組年齡41～78歲，平均(63.33±6.75)歲，其中14例具有單一高危因素，16例具有2項及以上高危因素；對照組年齡39～79歲，平均(63.33±4.03)歲，3組間年齡比較，差異無統計學意義(P>0.05)。

1.2 納入及排除標準

1.2.1缺血性腦卒中組 (1)納入標準：①符合《中國急性缺血性腦卒中診治指南2018》[4]的診斷標準；②經頭部CT或MRI證實。(2)排除標準：①1個月內有特殊治療史(放療、化療、手術及使用生物制劑)；②有腫瘤、風濕性疾病、出血及其他血栓栓塞性疾病。

1.2.2高危因素組 (1)納入標準：主要包括高血壓史、血脂異常、糖尿病、吸煙、超重或肥胖、有腦卒中家族史。①高血壓、糖尿病、血脂異常的診斷參考《內科學》(8版)。高血壓的診斷標準：非同日3次檢查的收縮壓≥140 mmHg(1 mmHg=0.133 kPa)和(或)舒張壓≥90 mmHg，或正在服用降壓藥。糖尿病的診斷標準：糖尿病癥狀，以及任意時間血漿葡萄糖≥11.1 mmol·L-1，或空腹血糖≥7.0 mmol·L-1，或餐后2 h口服葡萄糖耐量試驗血糖≥11.1 mmol·L-1，需重復檢測1次才能確認。血脂異常的診斷標準：甘油三酯≥2.26 mmol·L-1，或總膽固醇≥6.22 mmol·L-1，或低密度脂蛋白膽固醇≥4.14 mmol·L-1，或高密度脂蛋白膽固醇<1.04 mmol·L-1。②吸煙：每日超過1支，且連續吸煙1 a以上(戒煙6個月以上則認為不吸煙)。③超重或肥胖：體質量指數(body mass index，BMI)≥26 kg·m-2。(2)排除標準：①1個月內有特殊治療史(放療、化療、手術及使用生物制劑者)；②有腫瘤、風濕性疾病、出血及血栓栓塞性疾病等。

1.2.3對照組 健康者且無1.2.2中所描述的腦卒中高危因素。

1.3 檢測方法

1.3.1試劑與儀器 流式檢測試劑為BD公司生產的PE Mouse Anti-human IgG(Lot 7275972)、PE Mouse Anti-human CD62p(Lot 8274750)、FITC Mouse Anti-human CD41a(Lot 8197636)和FITC Mouse Anti-human IgG(Lot 8284569)。檢測儀器為BD FACSCanto Ⅱ型流式細胞儀。生化指標檢測使用Hitachi 7600全自動生化分析儀及配套試劑。

1.3.2血液標本采集 采集高危因素組和對照組空腹靜脈血，缺血性腦卒中組患者在入院未做任何治療前進行靜脈血采集。采用促凝靜脈血1 580×g離心10 min獲得血清，檢測血脂和血糖水平。

1.3.3PMPs表面CD62p測定標本的制備

1.3.3.1抗體的稀釋 將20 μL的PE Mouse Anti-human IgG、PE Mouse Anti-human CD62p、FITC Mouse Anti-human CD41a與FITC Mouse Anti-human IgG抗體用體積分數為50%的甘油(用0.01 mol·L-1且pH為7.4的PBS溶液稀釋)稀釋至2 mL。

1.3.3.2流式標本制作 獲得枸櫞酸鈉抗凝血后即刻110×g離心10 min，獲得富血小板血漿。將處理好的富血小板血漿分裝至500 μL的EP管中，每管10 μL，共計2管，標記為實驗管與對照管。實驗管中分別加入20 μL的PE Mouse Anti-human CD62p與FITC Mouse Anti-human CD41a，對照管分別加入20 μL的PE Mouse Anti-human IgG與FITC Mouse Anti-human IgG，吹打混勻后，室溫避光孵育30 min，隨后每管加入500 μL的4%(體積分數)的多聚甲醛4～8 ℃固定20 min，振蕩混勻后上機檢測。

2 結果

2.1 3組CD62p水平缺血性腦卒中組PMPs表面CD62p陽性率高于高危因素組，高危因素組高于對照組，差異有統計學意義(P<0.05)。見表1。

表1 缺血性腦卒中組、高危因素組和對照組PMPs表面CD62p水平比較

2.2 CD62p對缺血性腦卒中的臨床診斷價值對照組與高危因素組進行ROC分析，CD62p的曲線下面積(area under the curve，AUC)為0.869，取Youden指數(敏感性、特異性之和減1)最大點對應診斷界限值為9.22%，此時預測缺血性腦卒中高危風險的敏感性為66.7%，特異性為86.7%。高危因素組與缺血性腦卒中組進行ROC分析，CD62p對缺血性腦卒中的診斷效能高，AUC為1.000，Youden指數最大點對應的診斷界限值為29.94%。見圖1。

圖1 CD62p對缺血性腦卒中的臨床診斷價值

3 討論

缺血性腦卒中發生的根本原因是血小板在血管內活化引起的血管栓塞，在此研究基礎上，血小板活化相關標志物成為目前缺血性腦卒中發生發展研究領域的重要研究方向，其中，PMPs是現階段研究熱點。目前多項研究認為PMPs可以作為缺血性腦卒中有前景的生物標志物之一。依據細胞來源不同，將微粒體分為血小板微粒體、內皮微粒體、白細胞微粒體等。在健康者血液中，微粒體以來自血小板的微粒體為主，內皮細胞微粒體、白細胞微粒體及其亞群數量較少[5]。PMPs是血小板受刺激活化后產生的，體內PMPs的形成、釋放及水平可以反映體內血小板的活化程度，同時血小板微粒體也被認為是血管性疾病的標志物[6]。PMPs表面表達血小板膜上的多種糖蛋白，包括GPⅡb/Ⅲa、CD62p等，其中CD62p是血小板微粒表面的特異性糖蛋白，CD62p可介導血小板黏附于內皮細胞，并促進血小板中性粒細胞與血小板單核細胞的連接，激活中性粒細胞，釋放多種活性酶、細胞因子等血管活性物質，損傷內皮細胞，引起基膜通透性增加、細胞外基質增生、纖溶活性下降、纖維蛋白原沉積等多種生物學效應，啟動血栓形成過程。而PMPs是通過其表面的CD62p蛋白調節血小板功能的，因此，PMPs表面CD62p水平可以反映血小板的活化程度，進一步反映機體的凝血狀態[7-10]。

本研究選擇PMPs表面CD62p水平作為研究對象，結果顯示缺血性腦卒中組PMPs表面CD62p的水平高于對照組和高危因素組，說明在卒中發生時，機體的血小板活化極度活躍，該研究結果與現有研究結果[11-12]相符合。現有研究表明健康個體外周血中存在少量PMPs，在缺血性腦卒中急性期與慢性期外周血中PMPs水平均升高[11-12]。因此，本研究進一步為現有研究結果提供數據支撐，同時PMPs表面CD62p的檢測相較于PMPs水平檢測更直接反映血小板的活化程度，可以作為直觀指標應用于缺血性腦卒中的防控中。

目前關于缺血性腦卒中高危因素與血小板活化水平相關性的研究較少，缺少生物學指標，缺血性腦卒中的危險因素主要有高血壓史、血脂異常、糖尿病等，這些危險因素均可以通過破壞血管內皮細胞來誘導血小板活化，釋放出血小板微粒，有研究發現血小板表面CD62p、可溶性CD62p和PMPs水平與動脈粥樣硬化的危險因素[高血壓和(或)2型糖尿病和(或)血脂異常]呈正相關[13-14]。另外，長期吸煙人群血清和血小板膜上的CD62p水平也會升高[15-16]。動物實驗研究表明，吸煙可造成大鼠腦動脈血管內皮細胞的損傷，且隨著吸煙量增加及吸煙時間的延長，其血管內細胞的損傷程度也隨之加重。而超重或肥胖也能引起血管內皮細胞功能受損，進而誘導血小板活化，分泌血小板微粒[17]。以上研究說明高危因素能夠引起血小板的活化與PMPs的釋放。本研究中，高危因素組與對照組相比，高危因素組PMPs表面CD62p的水平也有升高，證實了高危因素人群血小板已部分活化，也說明機體處于血栓前狀態，一旦有誘導因素，腦卒中即可能發生[18]。同時，ROC曲線結果證實，PMPs表面CD62p對于缺血性腦卒中的診斷有一定價值，其作為預測腦卒中風險性的指標，也有較高的敏感度和特異度。因此，定期檢測高危因素人群PMPs表面CD62p水平，通過控制血壓、降脂、降糖、減肥、戒煙等消除高危因素，對腦卒中的預防具有重要意義[19]。

本研究雖然證明了高危因素組PMPs表面CD62p水平高于健康者，但還存在統計與檢測指標相對較少、未說明各個高危因素與PMPs水平相關性等問題，下一步計劃擴大標本量，將高危因素組人群進行細分，同時檢測血漿中游離CD62p、凝血酶水平等指標，完善樣本數據，為PMPs表面CD62p在臨床上的應用提供數據支撐。