干細胞移植治療阿爾茨海默病的研究進展

衣紅杰，王蕾，孟慶松，王海峰

(1.山東中醫藥大學，濟南 250014；2.山東中醫藥大學第二附屬醫院神經內科，濟南 250001)

阿爾茨海默病(Alzheimer′s disease，AD)是一種以進行性認知障礙和行為損害為特征的神經退行性疾病，其起病隱襲、進展緩慢，臨床表現為記憶功能障礙、失語、失用、失認、視空間能力損害、抽象思維和計算力損害、人格和行為異常等。AD病理復雜，其發病機制主要有膽堿能假說、Tau蛋白學說、淀粉樣蛋白級聯學說等，但隨著研究深入，學者還提出了多種假設：線粒體功能障礙[1]、小膠質細胞和星形膠質細胞等介導的免疫損傷[2-4]、載脂蛋白Eε4等位基因的變異[5]等引起的病理改變。其主要病理特征為淀粉樣斑塊和神經原纖維纏結；此外，還可見神經束絲、纖細的軸突、伴發的星形膠質細胞增生和小膠質細胞活化[6]。這些病理過程的發展結果包括神經變性、突觸丟失和神經元肉眼可見的萎縮。因此，臨床抗AD藥物或抗體的研發主要集中在抗氧化、清除腦中的β淀粉樣蛋白(amyloid β-protein，Aβ)沉積以及調節Tau蛋白的磷酸化三個方面[7-9]。目前，普遍使用的治療藥物為膽堿酯酶抑制劑、N-甲基-D-天冬氨酸受體選擇性拮抗劑，此外還有石杉堿甲和奧拉西坦等，但不管何種藥物，均是通過消除或阻止淀粉樣蛋白沉積和過度磷酸化的Tau蛋白來緩解AD患者癥狀，而不能修復其退化的神經元，同時還存在不可避免的不良反應。雖然近年針對AD的病理了解更深入，但仍未研發出針對此病的具體靶點藥物，不能逆轉病程發展，因此干細胞移植治療應運而生。現就干細胞移植治療AD的研究進展予以綜述。

1 干細胞移植簡述

20世紀80年代，Lindvall等[10]首次將干細胞移植應用到帕金森病中，并取得了良好的治療效果；隨后學者逐漸將該技術應用于其他變性病中，如AD、肌萎縮側索硬化癥和亨廷頓病[11]。干細胞具有無限或長期的自我更新能力，且可以朝某一方向分化，在體內外均可被誘導分化為神經元，其為從根本上治療AD提供了新的可能[2]。按不同的發育階段分類，干細胞可分為胚胎干細胞(embryonic stem cells，ESCs)和成體干細胞。目前，研究較廣泛的干細胞主要有間充質干細胞(mesenchymal stem cells，MSCs)、神經干細胞(neural stem cells，NSCs)、ESCs和誘導多能干細胞(induced pluripotent stem cells，IPSCs)。干細胞種類多樣，來源廣泛，易于分離，可操作性高，選擇合適的干細胞類型，可部分或完全避免免疫排斥反應帶來的移植后并發癥，降低移植風險。

2 干細胞移植在治療AD中的應用

2.1MSCs MSCs是從骨髓、臍帶、脂肪組織、外周血、羊水、肌肉、肺等器官和組織中分離出來的多能細胞[12-13]，沒有嚴重的倫理或技術問題。MSCs是一組專能干細胞的總稱，具有易于分離和獲取、高度增殖性、可分化多種類細胞，以及調節機體免疫功能的特點[2,14]，臨床常將其作為干細胞移植治療的首選干細胞類型。目前，以骨髓間充質干細胞(bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs)和臍帶間充質干細胞(umbilical cord mesenchymal stem cells，UCMSCs)等研究最為普遍。

2.1.1BMSCs 已有研究表明，神經炎癥是導致AD認知障礙的主要原因之一[15]。小膠質細胞是大腦中的主要免疫細胞之一，在神經炎癥中起重要作用。現在大量關于干細胞移植治療AD的研究均將小膠質細胞作為靶點。小膠質細胞具有促炎和抗炎作用，促炎因子會加重中樞神經系統的損傷，但抗炎因子會幫助改善神經功能[16-17]。AD患者腦內可見活化的小膠質細胞，小膠質細胞是Aβ斑塊的一種有效激活劑，可通過慢性促炎反應作用于Aβ斑塊，加快Aβ沉積。而Aβ又可以激活小膠質細胞產生細胞因子和神經毒素，導致神經元損傷和突觸丟失，促進神經變性[18]，由此形成惡性循環。小膠質細胞可以通過轉換表型使其抗炎作用占主導地位，而這種轉換需通過干細胞移植實現。將BMSCs移植入淀粉樣前體蛋白的小鼠海馬實驗顯示，BMSCs能夠通過激活小膠質細胞、緩解Aβ斑塊形成減少沉積和Tau蛋白的磷酸化，抑制神經毒性，且通過神經營養因子分化為神經元樣細胞，改善小鼠的認知功能[19-23]。同時BMSCs在移植后產生了多種神經保護劑，包括神經營養生長因子、趨化因子和細胞因子，對神經起重要的保護作用[24]。

2.1.2UCMSCs 臍帶是一種省時省力、非侵入性的干細胞來源，臍帶血中原始細胞較多，易于收集，與其他來源的MSCs相比，UMSCs自我更新及分化能力更強，致瘤性和免疫原性更低，且規避了倫理問題。

星形膠質細胞是大腦中的主要免疫細胞，在大腦的一系列神經發育和動態平衡過程中發揮重要作用，包括建立和維持突觸、細胞外神經遞質水平，以及維持血腦屏障正常功能[25-27]。腦源性神經營養因子修飾的UCMSCs移植到AD大鼠模型中可以增強星形膠質細胞的激活，減少Aβ的表達，并改善空間學習和記憶能力[28]。有研究顯示，移植神經元樣UCMSCs顯著增加了突觸蛋白-1的表達，突觸蛋白-1是突觸功能成熟和神經遞質釋放的重要蛋白，由此改善突觸傳遞，加強神經遞質的釋放[29]。有臨床試驗顯示：將UCMSCs移植到AD患者雙側海馬和一側楔前葉，受試者沒有出現不良反應，后期也沒有腫瘤形成及其他異常，但Aβ檢測顯示負荷并沒有改善，這一結果與上述動物實驗中UCMSCs能夠緩解Aβ斑塊形成的作用相悖[30]。以上研究表明，UMSCs的移植效果可能與檢測方法、腦內微環境甚至物種發展有關，即低級物種接受高級物種干細胞移植效果更好。

MSCs主要通過重建神經微環境，減少損害正常神經結構的因素(如減少Aβ的堆積)來支持神經生長、促進神經元的恢復，從而達到緩解和治療AD的目的[4,31-32]。MSCs主要以靜脈應用透過血腦屏障到達損傷部位[20，33]。在使用干細胞移植治療腦損傷的臨床前研究中，已經試驗了幾種不同的給藥途徑，包括腦室注射、腹腔注射、靜脈注射、鞘內注射、鼻腔注射和大腦皮質實質內注射。一項研究對靜脈移植和實質內移植MSCs治療腦缺氧損傷的差異進行比較發現，靜脈注射較實質內注射具有更好的效果[34]。

上述研究結果表明，使用MSCs并了解它們的細胞和分子作用機制對AD的治療有很大幫助；與ESCs或IPSCs相比，MSCs免疫應答低，并發癥少。雖然MSCs在細胞移植治療中應用多樣，但其分泌的因子類型和細胞信號轉導通路還不是很明確；同時需要一種更有效的方法提高MSCs利用率。一旦確定MSCs治療AD的機制和有效的使用方法，MSCs治療很有可能進入臨床實踐，成為最有前景的治療AD的干細胞類型。截至目前，UCMSCs的安全性和有效性已得到諸多臨床前和臨床試驗的驗證，因此UMSCs或可成為干細胞移植治療AD的首選。

2.2NSCs NSCs是一種自我更新能力強且具多向分化潛能的神經祖細胞，主要來源于胚胎或胎兒神經組織。隨著研究深入，現已發現NSCs也出現在成鼠的紋狀體、海馬齒狀回，人腦的嗅球、側室壁、大腦白質和海馬等哺乳動物中樞神經系統的部位，其中成人海馬的粒下區和腦室側壁室下區的NSCs[2，35]不僅能分化為神經元、少突膠質細胞和星形膠質細胞[36],且具有高遷移、高播散及低免疫原性的特點[2]。

海馬和皮質的膽堿能神經元減少，是目前公認的引起AD認知障礙的主要原因。NSCs廣泛參與哺乳動物大腦的動態平衡和修復，并表現出多效性的固有特性，這可能使其成為治療AD有潛力的候選細胞。一項使用人神經干細胞治療顱腦放療不良反應的試驗表明，注射人神經干細胞恢復了放療后海馬區神經元的可塑性[37]；研究顯示，NSCs移植顯著改善了記憶障礙和空間學習能力[38]。NSCs移植治療AD主要通過內源性和外源性兩種途徑達到修復和代替受損的神經細胞，重建細胞環路、改善細胞功能的目的。

內源性NSCs療法即當發生神經元損傷或變性時，利用自身的NSCs，動員靜止的神經干細胞[39-40]，誘導其增殖與分化，使受損傷的中樞神經系統進行修復。該方法相較其他細胞替代療法具有可避免免疫反應、減少腫瘤發生以及不涉及倫理問題等優勢，同時內源性NSCs擁有針對環境的變化調整增殖與分化速度的潛力，且這種能力并不局限于正在進行神經組織生成的區域。因此可以用各種干預手段對內源性NSCs進行調整和改善,促進其激活與增殖，最終遷移至靶區進一步分化整合[41]。然而，這種內源性神經發生不能抵消受損大腦中神經元的丟失。此外，神經退行性患者逐漸失去神經元，不能產生新的神經元來取代丟失的神經元[42-43]。

外源性NSCs療法主要是通過移植的方法，使其在體內存活、遷移并分化為功能性神經元，整合入宿主神經回路，修復神經功能[44-45]。有學者將胎兒端腦內的人神經干細胞移植到AD小鼠側腦室中，觀察到人神經干細胞在側腦室中分化為神經元和膠質細胞，這一過程可以改善空間記憶，減少Tau蛋白磷酸化和降低Aβ42水平、減少小膠質細胞病和星形膠質細胞病、增強內源性突觸發生以及增加神經元、突觸和神經纖維密度[46-47]。這些作用通過信號通路的調節、代謝活性、抗炎因子的分泌和細胞與細胞的接觸等機制實現。腦源性神經營養因子能夠改善海馬突觸密度和增加膽堿能神經元數量[48-51]，對移植NSCs改善AD大鼠的認知至關重要。此外，外源性NSCs在受體腦組織的病灶內遷移并分化為相應神經元的過程中，其分化方向與NSCs的內在和所在的微環境密切相關。

以上兩種途徑的研究表明，雖然外源性NSCs在治療AD中效果明顯，但其機制是NSCs分化的神經元替代了缺失組織，還是NSCs分泌的細胞因子或移植的NSCs激活了某些信號通路促進了神經發生[52]，目前尚不清楚；內源性途徑雖在一定程度上避免了免疫原性和倫理限制[53]的問題，但這兩種途徑均存在的重要缺陷為將NSC移植入成體中樞神經系統非神經元部位，絕大部分細胞因為受體腦內微環境影響并不向神經元方向分化，分化條件無法掌控，在腦內存活數量不足[11,54]。NSCs移植可以補充AD患者缺失的神經元，但因目前醫學技術的局限，仍無法精確提高NSCs的體外行為與其對腦環境的適應度，故還需要廣泛的基礎研究。

2.3ESCs ESCs是胚胎發育囊胚期的多能干細胞，被稱為“最原始”的全能干細胞，ESCs從外胚層、中胚層和內胚層產生體細胞及具有自我更新的能力，決定了其多能性,可以誘導分化為任何方向的細胞[2,55]。

基底前腦膽堿能神經元在AD患者腦中受到嚴重破壞，將小鼠ESCs成功分化產生的基底前腦膽堿能神經元移植入AD大鼠腦中后，其雖然推動了大鼠腦中神經元的衍生，明顯改善了記憶，但也出現了鼻咽癌的分化[56]。有研究將人ESCs在體外產生的膽堿能神經元，移植到培養的小鼠內嗅海馬切片上，發現它們可以和現有的神經元網絡相連[57]，達到改變認知的效果。美國食品藥品管理局批準的第一個使用人類ESCs衍生細胞的臨床試驗于2010年由Geron公司啟動，標志著設計人ESCs移植的臨床試驗正式啟動。雖然ESCs具有許多優點，但為了達到研究目的，ESCs多是從體外受精的卵子中發育出來的胚胎獲得，由此引發的倫理問題和潛在的免疫排斥反應使其臨床應用存在較大爭議，且直接移植ESCs存在分化方向難以調控、細胞增殖失控[2，56]和腫瘤發生、胎瘤形成等問題[58-59]。因此需要更新的方法改善供體細胞和受體的相容性，防止潛在的免疫反應[60-61]。

2.4IPSCs IPSCs的原理是通過向體細胞中轉入若干轉錄因子，使其逆向重編程回到ESCs樣狀態具有干細胞的基本特性[62]。除來源外，IPSCs的其他特征與ESCs幾乎完全一致，具有多項分化潛能，并能夠在體外自我更新，理論上可以誘導分化為成體生物體內的所有細胞類型。IPSCs通過特定的重編程基因的傳遞，各種類型的體細胞(如皮膚成纖維細胞和外周血單核細胞)可通過誘導達到類似ESCs的狀態，發揮ESCs的作用。因此，IPSCs技術可以解決與使用ESCs有關的短缺和復雜的社會問題。借助IPSCs可以從患者自身產生多能細胞，進行自體移植，解決免疫排斥反應和倫理限制的問題[63]。將人IPSCs誘導分化為神經元細胞，并移植到具有Aβ沉積和空間記憶障礙的小鼠海馬中，觀察到細胞分化為膽堿能神經元，且記憶障礙有所好轉[64]。

目前國內外學者對IPSCs的研究時間尚短，研究過程受技術等條件限制，IPSCs的應用仍面臨許多挑戰，如如何概括散發性疾病的表型，以及如何選擇理想的表型和進行大規模藥物的篩選。但現在已經開發了許多新策略，可以與以IPSCs為基礎的模型相結合來解決這些問題，包括有機體技術、單細胞RNA測序、基因組編輯和深度學習人工智能等[65]。

3 問題與展望

迄今為止，多種動物實驗、體內外實驗結果表明，干細胞可以有效填補AD患者丟失的神經元，為AD的治療提供新思路[2,29,37]；同時，通過研究干細胞誘導激活分化為神經元的機制，還可以進一步明確神經元的產生與凋亡機制，為AD的病理研究提供新領域。

但目前仍缺乏對干細胞移植后腦修復因素的分析研究，在如何消除免疫排斥反應、提高移植干細胞存活率、獲得有效臨床級數量、獲得活化年輕的干細胞、選擇給藥途徑以及防止回輸后干細胞適應腦內微環境等方面面臨巨大挑戰。目前，有關應用干細胞移植技術治療AD的研究大多停留在動物模型實驗階段，其臨床應用較少。未來的臨床前研究應特別強調安全性，確定最佳的細胞來源和輸送方法，并積極評估AD患者腦內微環境中干細胞的分化反應，積極隨訪。

4 小 結

AD發病率逐年上升，目前尚無有效治療手段，干細胞移植可能成為一種治療AD的有效方法。豐富的動物實驗為臨床試驗提供了可靠的理論依據，提高干細胞移植在臨床的可行性。干細胞種類多樣，其中MSCs以其易獲取、可自我更新、多向分化等特點成為首選干細胞類型。但干細胞的作用機制仍未完全闡明，人類臨床試驗仍處于初起階段，為使更多AD患者獲益，需建立完備的動物實驗和臨床試驗的數據標準，反復驗證其安全性、有效性，準確把控倫理問題，盡早實現干細胞移植治療AD。