Neuritin 神經可塑性機制研究

趙秋語，陳 黎，胡 敏

（昆明醫科大學第四附屬醫院暨云南省第二人民醫院眼科/云南省眼部疾病臨床醫學研究中心/云南省眼科研究所/云南省眼病臨床醫學中心，云南 昆明 650021）

神經氨酸（Neuritin）最初是在海藻酸誘導的海馬齒狀回中發現的一種與神經可塑性相關的神經營養因子，因其編碼的蛋白質能夠促進神經突起的快速生長而得名，也被稱為候選可塑性相關基因15（candidate plasticity-related genes15，CPG15）[1，2]。作為一種神經營養因子，Neuritin 在神經系統中發揮著許多作用，其中神經可塑性及機制的研究備受關注。弱視是目前我國常見視覺障礙中的一種[3]，近年來研究顯示弱視的發生與視覺神經通路的發育異常有著密切關聯[4，5]。但現今弱視的治療方案多為壓抑優勢眼、屈光矯正及視覺訓練，甚少有關于視覺神經通路可塑性藥物治療方面的研究，Neuritin 的神經可塑性可能為弱視及其他視覺系統損傷疾病提供新的治療思路。

1 Neuritin 對神經系統的作用及機制

Neuritin 是神經活動和神經營養因子家族（NTs）共同作用的下游因子。在早期胚胎發育過程中，Neuritin 在大腦多個區域表達，并充當神經祖細胞和分化神經元的生存因子[6]；發育的后期，Neuritin促進軸突和樹突狀樹突的生長和穩定以及突觸形成和成熟[7，8]；成人大腦中，Neuritin 持續表達，其表達與活動依賴的功能的可塑性相關[9]。因而Neuritin 在神經可塑性領域有著良好的應用前景。

1.1 抑制細胞凋亡，促進神經損傷后的恢復 Zhang H 等[10]認為Neuritin 在蛛網膜下腔出血（SAH）后可通過減輕血腦屏障破壞、腦水腫和細胞凋亡對早期腦損傷（EBI）發揮神經保護作用，而這種作用可能是通過抑制內質網應激（ERS）介導的凋亡途徑來實現。Gao R 等[11]發現Neuritin 在實驗性大鼠脊髓損傷（SCI）模型中創造了促進神經細胞存活和神經突再生的環境，從而有助于神經再生和運動功能的恢復。另一實驗研究也證明[12]，Neuritin 治療不僅增加了坐骨神經損傷中的坐骨纖維密度和組織以及髓鞘再生程度，而且還促進了腓腸肌肌肉力量和神經傳導速度恢復。最近的研究顯示[13]，Neuritin 可通過改善施萬細胞的存活率和功能從而改善大鼠糖尿病性神經病中神經元的生長。以上研究證明，Neuritin 在中樞及周圍神經中均有明顯的促進損傷修復作用，但具體的修復機制仍有待探究。

1.2 促進突觸發育及神經元遷移 有研究者為了研究突觸成熟過程中對Neuritin 的需求，建立了一個CPG15 基因敲除（CPG15 KO）小鼠模型，發現這些小鼠的軸突和樹突狀樹突形成存在明顯的發育延遲[14]。電生理研究還表明，突觸的成熟被延遲，電子顯微鏡發現許多樹突棘最初都缺乏功能性的突觸接觸。Subramanian J 等[15]發現Neuritin 可通過募集突觸后致密蛋白（PSD95）促進興奮性突觸的穩定和成熟。他們利用雙光子成像觀察到Neuritin 利用其糖基磷脂酰基醇錨（GPI 錨）與AMPA 受體（AMPAR）相互作用可使PSD95 募集到新生的棘突從而促進神經元細胞軸突的生長及突觸的成熟，而PSD95 募集反過來會促進AMPA 受體與未成熟突觸的接觸，從而產生結構穩定且功能成熟的突觸。此外也有研究表明[16]，Neuritin 能夠促進神經元細胞的遷移,實驗發現Neuritin 在永生的神經元（GN11 細胞）遷移的小鼠模型中高表達，而在非遷移的神經元（GT1-7 細胞）中沒有表達。同時，當Neuritin 過表達或者沉默時，GN11 細胞出現了相對應的遷移增強或減弱。這些結果提示Neuritin 在神經系統的發育和成熟過程中起著不可替代的作用。

1.3 參與神經可塑性的調控 唐娟等[17]觀察到Neuritin 可使DRG 和PC12 細胞出現濃度依賴性的神經突增生。在NGF 的誘導下Neuritin 能使DRG 和PC12 細胞表現出更強的分化作用，其細胞突起數量及長度明顯增加，相反，在缺乏Neuritin 的培養環境下幾乎觀察不到神經突生長。在大鼠抑郁癥模型中海馬神經元樹突分支減少，同時Neuritin 基因在海馬神經元中的表達由于慢性不可預測的壓力（CUS）而降低，而病毒介導的Neuritin 蛋白在海馬中的表達可防止CUS 引起的樹突和樹突棘萎縮[18]。

近年來，有研究者發現Neuritin 蛋白可能在聽覺剝奪的情況下對上橄欖巖旁核（SPON）神經元的存活和發育起重要作用[19]。SPON 神經元在動物發聲和人類語音中編碼節奏信息起重要作用，他們發現與正常聽覺的小鼠相比，在耳聾小鼠的SPON 中可溶性的Neuritin 被上調，膜時間常數減少和Ca2+電流的募集減少，從而使聽覺剝奪小鼠的精確反彈峰值正常化，推測Neuritin 可能促進了神經元的存活并延長了SPON 電路的可塑性。以上這些研究表明Neuritin 在神經可塑性中起重要作用。

2 Neuritin 分子生物學特性

2.1 Neuritin 基因的表達調控 在神經系統中，神經活動和神經營養因子均能單獨誘導Neuritin 的表達，但二者誘導Neuritin 表達的分子機制明顯不同。Neuritin 是許多經典突觸可塑性信號級聯反應的下游因子[20]，包括N 一甲基一天冬氨酸（NMDA）受體、促分裂原活化蛋白激酶（MAPK）、鈣離子及鈣調蛋白依賴的蛋白激酶（CaMK）和cAMP 反應結合蛋白（CREB）。目前認為，神經活動可以通過激活NMDA受體或者直接使L 型電壓敏感鈣通道（VSCCs）開放，鈣離子內流，進一步激活鈣離子及鈣調蛋白依賴的蛋白激酶CaMK 和MAPK 通路，最終促使一系列的轉錄因子包括CREB 激活，并與Neuritin 基因的啟動子結合啟動轉錄。

多種神經營養因子均能單獨誘導Neuritin 蛋白的表達，表明Neuritin 是NTs 發揮作用的共同下游因子。在成年大鼠的齒狀回中外源性注入腦源性神經營養因子（BDNF），觀察到Neuritin mRNA 的表達上調[21]。在神經元祖細胞（ST14A）中過表達神經膠質源性神經營養因子（GDNF），發現Neuritin 等基因表達上調[22]，推測GDNF 通過誘導Neuritin 的表達從而參與神經組織的發育和維持。

除以上因素外，雄激素及HuD 蛋白也與Neuritin 基因的表達有關。有實驗發現使用睪丸激素治療可使神經損傷的倉鼠體內的NeuritinmRNA 水平增加數倍，而使用氟他胺（雄激素受體阻滯劑）同時治療時NeuritinmRNA 并沒有出現變化[23]，這證實雄激素是通過雄激素受體對Neuritin 基因的表達進行調節。HuD 是Hu 蛋白家族中一種神經特異性的mRNA 穩定性調控因子，有研究顯示[24]，HuD 可以直接與Neuritin 結合并穩定Neuritin mRNA，提示HuD可能參與了Neuritin mRNA 的穩定性調控。

通過以上研究結果可發現Neuritin 的表達受到多方面的調控，但目前對于各個調控通路之間是否相關或相互影響并未見相關研究。

2.2 Neuritin 相關信號通路及分子機制 盡管已知Neuritin 通過與受體結合發揮非細胞自主作用[7]，但就目前而言，Neuritin 仍被認為是一種孤兒配體，尚未確定特定的Neuritin 受體，下游效應因子尚不清楚。

2.2.1 Neuritin 與胰島素受體（IR）有研究表明[25]，將小腦顆粒神經元（CGNs）與Neuritin 一起培養可增加CGNs 在時間和濃度依賴下瞬時外向鉀電流（IA）的密度，這些變化是由Kv4.2（IA 通道的主要亞基）轉錄和翻譯的增強而引起。將胰島素注射到CGNs也可以誘導IA 密度增加以及Kv4.2 表達增加，從而推測Neuritin 引起的Kv4.2 表達增強可能與IR 激活有關。生化分析表明，Neuritin 可以激活IR，而通過藥理學阻斷IR 可完全抵消Neuritin 引起的作用。盡管缺乏證據表明Neuritin 可直接與IR 結合，但以上的研究結果表明Neuritin 可能是IR 的潛在配體。

2.2.2 Neuritin 激活絲裂原激活的蛋白激酶-細胞外信號調節激酶（MEK-ERK）和PI3K-Akt-mTOR 通路 ERK 通路是NGF 和IR 信號轉導的靶標。Ying Y 等[25]將CGNs 與Neuritin 一起培養30 min 可增加ERK1/2 的磷酸化，而加入MEK/ERK 通路阻滯劑U0126 后，由Neuritin 介導的IA 的密度增加以及Kv4.2 的表達增加都被逆轉。與ERK 相似，孵育過程中Akt 和mTOR 的磷酸化均增加，但二者反應速度不同且均慢于ERK，同樣，加入相應阻滯劑后可逆轉Neuritin 介導的反應。

2.2.3 Neuritin 激活NFATc4/Ca2+/CaN 通路 Zhao QR等[26]利用鈣成像和蛋白質印跡分析發現Neuritin 可增強高K+誘導的細胞內Ca2+水平的增加，并刺激CaV1.2 和CaV1.3（L 型鈣通道的亞基）的細胞表面表達，進而抑制IR 或促分裂原激活的蛋白激酶激酶/ERK。也有其他研究稱，Neuritin 可能是刺激CaV3.3α（T 型鈣通道的亞基）的細胞表面表達[27]。利用L 型鈣通道抑制劑、鈣調蛋白和鈣調神經磷酸酶（CaN）可消除Neuritin 對神經突長度和脊柱密度的影響。另外，通過沉默活化的T 細胞核因子（NFAT）c4 也獲得了相似的結果，而該因子在CGNs 中可被Neuritin 激活[28]。

綜上所述，Neuritin 可能通過IR、ERK/PI3KAkt-mTOR 通路以及NFATc4/Ca2+/CaN 導致Kv4.2上調并增加IA 密度，進而對CGN 中神經突和脊柱生長產生影響。

2.2.4 其他信號通路 李賀等[29]建立神經元樣Neuro-2a（N-2a-N）細胞損傷模型，發現Neuritin 能夠上調并激活ERK1/2 和信號轉導及轉錄激活因子3（STAT3），進而介導白血病病毒前病毒插入位點1（Pim-1）和GAP-43 蛋白表達，促進受損N-2a-N細胞神經突起的再生。Shimada T 等[30]發現Neuritin與成纖維細胞生長因子（FGF）共同作用可以減少苔蘚纖維的生長，而這一過程是通過FGF 通路引發的。在實驗性糖尿病性神經病中，Nan G 等[31]發現Neuritin 與酪氨酸激酶A（TrkA）受體共同定位于大鼠DRG 神經元中，然而目前并沒有直接的證據表明神經氨酸激活了TrKA 受體。Pan Z 等[32]發現Neuritin和神經化的E3 泛素蛋白連接酶1（NEURL1）（Notch調節劑）之間存在相互作用。重組Neuritin 恢復了由Notch 激活引起的神經突回縮，而Neuritin 刺激的神經突生長被NEURL1 部分阻滯，這提示Neuritin 是NEURL1 的上游和負調節劑，可抑制Notch 信號傳導從而促進神經突生長。

3 Neuritin 與視路

3.1 Neuritin 在視路中的分布 Neuritin 在視路中廣泛表達，主要分布在視網膜、視神經、外側膝狀體、視皮層及視上丘[2]。在視網膜中Neuritin mRNA 僅在視網膜神經節細胞層中被檢測到，且集中于軸突。Fujino T 等[33]搜索到了一個稱為CPG15-2 的潛在旁系同源物。CPG15-2 也是一個活性調節基因，其基因組結構與CPG15 相似，但二者分布區域不全相同。與CPG15 在大腦皮層和海馬中的含量最高相反，CPG15-2 mRNA 在視網膜和嗅球中含量最高。在視網膜中，CPG15 集中于視網膜神經節細胞（RGCs），而CPG15-2 主要在雙極細胞中表達。但是迄今為止，還缺乏關于CPG15-2 的研究。

3.2 Neuritin 基因表達在視路發育過程中的變化 通過原位雜交的方法分別觀察貓和大鼠從視覺發育初期到成年期全過程中初級視皮層Neuritin mRNA 表達變化，發現Neuritin 基因表達高峰出現在視覺發育關鍵期[34，35]。陳霞等[36]觀察到正常發育大鼠視皮層中的Neuritin mRNA 和蛋白表達與視覺經驗和年齡有關，在視覺發育關鍵期達到高峰，且單眼形覺剝奪會明顯影響視皮層中Neuritin 的表達。這些研究均表明Neuritin 基因可能參與視覺神經系統發育的全過程，并且在視覺發育關鍵期參與視皮層神經元可塑性的調節，由此可推測Neuritin 是參與視覺發育可塑性變化的分子基礎之一。

3.3 視路可塑性與Neuritin 基因的表達調控 研究表明[37]，Neuritin 在大鼠視覺皮質的表達具有光誘導性。將正常大鼠置于黑暗環境2 周后，其視皮層中的Neuritin 表達減少，而給予光刺激4 h 后其表達又回復到原來的正常水平。但有研究發現[35]，Neuritin 基因表達調節分為兩個階段：早期的表達雖與睜眼時間相吻合，但并不受暗環境、視網膜驅動動作電位或單眼剝奪的影響，表達相對獨立；在視覺發育關鍵期，Neuritin 表達的活性依賴成分出現，并且隨著年齡的增長，視網膜動作電位阻滯的作用變得更加明顯。

偉偉等[38]在大鼠視神經損傷模型中發現Neuritin 基因在受損視神經中表達上升，而Neuritin 基因過表達可提高RGCs 的活性。另一研究報道稱[39]，Neuritin 在體外和體內軸突損傷后對神經切除的RGCs 均表現出神經保護、再生作用并保留了RGCs功能，研究者通過腺相關病毒（AAV）介導的Neuritin 過表達延遲了RGCs 凋亡，再生了受損軸突并維持了視神經損傷后RGCs 的功能，從而支持了Neuritin 的視神經保護作用。Huang T 等[40]對Neuritin 對視神經損傷的修復機制進行進一步研究，認為Neuritin 的功能性分子激活了Akt1 和STAT3 途徑，并抑制了線粒體的凋亡途徑。Azuchi Y 等[41]研究了視神經損傷（ONI）對Neuritin 基因敲除（KO）小鼠視網膜變性的影響。在ONI 小鼠模型中Neuritin mRNA 上調，對于剔除Neuritin 基因的成年小鼠，其視網膜結構和RGCs 數量正常，而剔除Neuritin 基因小鼠的ONI 模型顯示RGCs 死亡和視網膜內部變性更為嚴重，提示Neuritin 蛋白促進了損傷后RGCs存活和軸突再生。Picard N 等[42]指出，小鼠胚胎時期Neuritin 的整體敲除會導致出生后視覺皮層中興奮性網絡的異常發育以及相關視覺感受野特性發展中斷。此外，盡管重復的視覺刺激會引起野生型小鼠視皮層細胞反應的增強和抑制，但Neuritin 基因敲除小鼠抑制卻較慢，表明短期抑制機制的損害。

以上研究顯示在不同的損傷模型中，Neuritin可以在不同階段被下調和上調，但是神經損傷后Neuritin 總體水平會增加，表明Neuritin 在視覺系統神經可塑性中起到重要作用。

4 總結

目前弱視的定義仍在強調臨床檢查無可見器質性病變，但已有研究可以證明弱視的視網膜超微結構出現變化，并且具有一定的可塑性和可塑期，具體機制尚不清楚。Neuritin 目前雖然較少應用于弱視研究，但通過探究Neuritin 的神經可塑性與視路可塑性的關系可以發現，其分布與弱視的解剖變化部位有重合，且其表達變化與視覺關鍵期的形成一致，推測Neuritin 可能作為重要的一環參與了弱視的形成。因此對于Neuritin 的深入研究可能為今后弱視的發病機制及藥物治療的研究提供新的思路。