宮頸組織免疫組化染色檢測P16/Ki67的表達在LSIL和ASC-US中的應用價值

楊海清，劉蕊婷，張月茹，李錫祥，黨鴻蔚，任 艷，崔曉賓，劉春霞，胡建明

(1.石河子大學醫學院，新疆石河子 832002；2.石河子大學醫學院第一附屬醫院，新疆石河子 832008）

宮頸癌是常見的婦科惡性腫瘤之一，其發病率在我國女性惡性腫瘤中僅次于乳腺癌，全球每年宮頸癌的新發病例數大約為53萬例，中國的死亡病例數約為2.6萬例[1]，但宮頸癌的發生需要歷經眾多階段，及時、準確發現宮頸癌前病變，預測其發展方向并選擇恰當的診治策略具有重要臨床意義。宮頸上皮內病變（cervical intraepithelial neoplasia,CIN）與宮頸浸潤癌密切相關，是宮頸癌的癌前病變之一，根據其病變程度可將其分為低級別鱗狀上皮內病變（LSIL，CIN Ⅰ）和高級別鱗狀上皮內病變（HSIL，CIN Ⅱ，CIN Ⅲ），其中，大部分低級別鱗狀上皮內病變可自行消退或治愈，少部分有向更高級別病變甚至宮頸癌發展的風險。未明確意義的非典型鱗狀細胞(atypical squamous cells of undetermined significance，ASC-US)既可能提示著宮頸發生了HPV感染或其他惡性病變，也可能僅代表炎癥等良性反應發生，ASC-US 是細胞學診斷的灰區。臨床對于LSIL 和 ASC-US 的干預與治療仍處于困境之中。P16 蛋白和Ki67 蛋白在細胞中的過表達提示細胞周期混亂，免疫組織化學染色檢測P16和Ki67 陽性與HR-HPV感染有關，大量研究已驗證P16，Ki67 染色在宮頸癌篩查應用中的可行性及檢測結果的可靠性。本文對宮頸組織進行免疫組織化學染色檢測P16和Ki67的表達在LSIL和ASC-US中的應用價值作綜述。

1 P16和Ki67的功能及其共表達

1.1 P16的功能及其表達意義 P16 通常由染色體9p21 基因編碼，參與細胞周期調控，發揮細胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑的作用。P16 阻斷了CDK4與CDK6 介導的pRb 磷酸化反應，非磷酸化的pRb同轉錄因子E2F 結合，抑制細胞進入S 期，從而達到對細胞周期的負性調控作用[2]，反之，當P16基因失活時，CDK4 被細胞周期蛋白結合，正常的Rb 蛋白磷酸化抑制機制失調，轉錄因子 E2F 與磷酸化的Rb 解離并活化，是細胞周期的轉錄基因被激活，形成異常細胞周期。因此正常細胞中P16基本不表達，當細胞周期調控機制異常時，P16 增殖活躍，P16 過表達通常提示細胞周期阻滯。在宮頸癌病變發生過程中，HPV感染并整合至宿主細胞DNA 致使E6和E7 癌蛋白持續高表達,使細胞周期失衡，P16 蛋白隨之呈現過度表達狀態[3]，因此P16 過表達可被認為提示了E7 癌蛋白表達失調，當P16 過表達并且在細胞內積聚時便提示發生了宮頸癌前病變，其表達可通過免疫組織化學染色方法來進行檢測[4]。近年來，P16 免疫組織染色法逐漸被推薦用于區分HSIL 和無關的腫瘤性疾病，研究表明P16 免疫組化染色可作為預測CIN 進展的特異性生物標志物[5]。但是，HERFS 等[6]的報道中指出，僅僅依靠P16 檢測并不能準確診斷宮頸上皮內瘤病變，要想達到明確診斷需要聯合其他標記物。

1.2 Ki67的功能及其表達意義 Ki67 是一種增殖細胞的相關抗原，由染色體10q25 基因編碼。Ki67在靜止期細胞中基本不表達，而在增殖的細胞中普遍存在表達，在不同的細胞進展周期中發揮著不同的作用。Ki67 免疫組織化學染色陽性通常提示細胞處于細胞周期增殖期，因此它可作為腫瘤細胞增殖的標志物，預測腫瘤的惡性潛能，Ki67表達越高，腫瘤惡性進展的風險也就越高[7]。在宮頸癌中，Ki67 能反映癌細胞的分化程度，對臨床腫瘤診斷可起到輔助作用[8]，Ki67 標記指數（LI）會隨著宮頸病變組織學分級的增加而增加[9]，同時Ki67的表達與病變的嚴重程度乃至生長速度之間存在一定關聯，證實了Ki67表達在HPV 引起的宮頸病變分析中具有一定的應用價值[10-11]，目前Ki67的檢測被廣泛作為宮頸癌前病變和其他癌癥的輔助診斷[12]。

1.3 P16/Ki67的共表達 P16和Ki67 分別作為腫瘤抑制因子和細胞增殖標記物，在正常狀態下P16的過表達和Ki67的表達相互排斥，通常不會發生于同一宮頸上皮細胞中，如果出現P16，Ki67 共同表達則意味著高危型HPV 誘導的細胞周期異常。共表達的P16和Ki67 可作為預測高危型HPV 誘導細胞轉化和CIN 高級別病變的標志[12]，因此免疫組織化學P16/Ki67雙染檢測法可被作為宮頸癌前病變和宮頸癌的篩查診斷手段。

2 P16/Ki67雙染檢測法與其他方法比較

細胞學檢測方法作為宮頸早期篩查手段已作為一項重大公共衛生決策被許多國家所接受并執行，但長期實踐表明細胞學檢測法在制片、診斷等方面均存在主觀性強、依賴醫生經驗且無法判定LSIL和ASCUS 患者的病變進展方向等不足。關于P16/Ki67雙染檢測法與細胞學檢測法在宮頸病變中的應用價值，不同研究存在不同的觀點。WRIGHT 等[13]通過對980例病例進行P16/Ki67雙染和TCT 檢測后發現，雙染檢測法對宮頸CIN Ⅱ和CIN Ⅲ病變診斷的敏感度和特異度均高于TCT 檢測，說明相比細胞學檢測法，雙染檢測法在提高診斷準確度等方面可能具有更好的價值。WRIGHT 等[13]人的研究顯示雙染檢測與細胞學檢測法相比特異度相似，但其有更高的靈敏度，西班牙的一項研究與此相反，AREáN-CUNS 等[14]的結果顯示的是在對HPV 陽性患者進行分流時，雙染檢測的靈敏度與細胞學檢測方法相當，但其特異度顯著超過細胞學檢測法，這說明雙染檢測法在病變檢測的靈敏度和特異度方面也存在一定的不穩定性，但總的來說，與細胞學檢測方法相比，雙染檢測法在結果判定等方面相對客觀，因而在篩查宮頸病變方面具有更大的潛力。

HPV檢測法是宮頸病變的檢測方法之一，它被認為有較強的靈敏度。但HPV檢測法僅能檢測有無病毒，無法區分病毒的一過性感染和持續性感染，而一過性的HPV感染在宮頸惡性病變環節不發揮作用，持續性的HPV感染才是導致宮頸病變的原因。同時，宮頸病變診斷的目的是判斷宮頸是否發生了病變，但HPV檢測陽性不代表宮頸發生了病變，它僅能說明未來宮頸癌發生的風險增加。HPV DNA檢測用于宮頸癌診斷的靈敏度、特異度及準確度均不高，尚不足以作為單獨檢測診斷宮頸癌的依據[15]。有關研究顯示在異常宮頸病變的診斷中，P16/Ki67雙染在不降低靈敏度的同時提高了特異度，相對雙染檢測法具有更好的診斷效能。WENTZENSEN[16]的結果表明，在對CIN Ⅱ及以上病變的診斷中，P16/Ki67雙染法比起HPV檢測具有更高的特異度。同時，有研究顯示，與HPV檢測相比，P16/Ki67雙染檢測法對于異常宮頸病變具有更好地分流能力[17]和費用效能[18]。

一些將P16/Ki67雙染檢測法、細胞學檢測法和HPV檢測法聯合比較的研究也表明，P16/Ki67雙染法在檢測宮頸病變時可以作為一種更有價值的檢測手段。在WANG 等[19]的研究中，P16/Ki67雙染法對異常宮頸病變檢出的靈敏度明顯高于LBC 法和HPV16/18 基因分型，在GE 等[20]的研究中，雙染檢測法對CIN Ⅱ及其以上病變的敏感度與TCT和高危型HPV 篩查相當，但特異度顯著高于其他兩種，與此相同，黃美虹等[21]人的研究也證實了雙染檢測法在診斷HSIL 時能在不降低靈敏度的同時提高特異度，且具有更高的陽性預測值，這說明雙染檢測法能夠提高宮頸病變診斷的準確性。在對HPV檢測陽性患者進行分流的應用中，賈漫漫等[22]人證明P16/Ki67雙染檢測法也有較好的效能，她們的研究以CIN Ⅱ為疾病終點指標，發現雙染檢測的靈敏度與LBC 檢測相等，高于HPV檢測，特異度高于其他兩種檢測方法，其陽性預測值和陰性預測值與其他兩種方法相比也更占有優勢，具有更好地分流效能。

3 免疫組化染色檢測P16，Ki67在LSIL中表達的應用

根據美國國家綜合癌癥網絡( NCCN) 宮頸癌篩查指南，LSIL 病例的治療以臨床觀察為主[7]，對LSIL 的積極治療可能導致了醫療資源的浪費，造成患者的心理負擔，消極治療又可能導致癌前病變進展為癌癥，但因約10%的LSIL 會進展為HSIL，尋找一種適宜手段合理管理LSIL 病例勢在必行。

3.1 P16 在LSIL中的應用價值 多項研究表明，P16 免疫組織化學染色的陰陽性結果和陽性表達率對LSIL 的進展傾向有預測價值。馬新義等[7]在研究過程中收集了84例LSIL 病變病例和22例良性反應病例,他們發現在LSIL 病例中，P16的陽性表達率高于宮頸正常和炎癥病例，這提示了P16 可以作為區分LSIL 和良性反應性改變的鑒別診斷因子。SARI 等[23]人的研究提示在低級別宮頸上皮內瘤變中，P16染色彌漫陽性病例更傾向于發展至高級別病變，P16染色陰性則存在較高的倒退傾向，BENEVOLO 和CHAROONWATANA 等[24-25]的 研究與此相同，BENEVOLO 等[24]的研究發現P16染色彌漫陽性的LSIL 病例有更高地可能性向高級別進 展，CHAROONWATANA 等[25]對96例LSIL 的隨訪結果顯示P16染色結果為陰性的病例僅有3.6%進展為高級別病變，這說明宮頸組織P16染色結果對評估LSIL 病變是否會向更高級別病變發展有著重要作用。另外一些研究證明，P16染色的陽性率越高，LSIL 病例進展的可能性越大。馬新義等[7]在對84例LSIL 隨訪12個月后發現，LSIL 進展組病例中 P16 陽性表達率為76.9%，高于持續組(25.0%)和消退組(19.1%)；NEGRI 等[26]的研究與此相似，在對LSIL 進行隨訪后，他們發現P16 陰性和彌漫陽性的LSIL 病變分別有71.4%和37.8%回歸，而28.6%和62.2%的陰性和彌漫陽性的CIN Ⅰ病變進展為高級別病變，這提示P16染色陽性率對判斷LSIL 病人在后期是否會向高級別病變進展具有預測作用。

3.2 Ki67在LSIL中的應用價值 Ki67 可作為宮頸病變的標記物，其染色結果也可提示LSIL 病例發展傾向。馬新義等[7]的研究同時顯示Ki67 陽性表達率均高于宮頸正常和炎癥病例，Ki67 可以作為區分LSIL 和良性反應性改變的鑒別診斷因子。KRUSE 及其團隊[27]隨訪了44例LSIL 病例，發現Ki67 染色結果預測LSIL 發生進展的靈敏度為100%，特異度為56%，說明大部分的進展病例是能通過Ki67 染色結果預測到的。馬新義等[7]在后期隨訪后發現LSIL 進展組Ki67 陽性表達率高于持續組和消退組，賴婷等[28]的研究與此相似也顯示了LSIL 進展患者的組織中Ki67的陽性表達率也明顯高于 LSIL 未進展組，由此可以看出，Ki67的陽性表達率越高，LSIL 病例進展為高級別病例的可能性也就越大。ALSHENAWY 等[29]人則發現Ki67的表達隨CIN 等級升高逐漸增加，癌癥組織中，Ki67的表達率達到100%，因此，不難得出結論，Ki67的表達率可能是評估LSIL 病變的有效預測因子。

3.3 P16/Ki67雙染在LSIL中的應用價值 國內外的多項研究表明P16/Ki67雙染在LSIL中的轉歸具有預測意義。邱曉陽等[30]通過對LSIL 病例進行隨訪并結局分為進展、持續和消退三組，他們發現P16/Ki67雙染陽性的LSIL 病變進展率是陰性的3倍，雙染陽性診斷LSIL 病變持續率是陰性的1.2 倍，黃美虹等[23]使用了相似的研究方法，她們的研究顯示LSIL 病變進展的病例中，P16/Ki67雙染陽性病變進展是陰性的2 倍，這說明雙染結果陽性可作為LSIL 病例會發生進展的指征。在VRDOLJAKMOZETIC 等[31]的研究中P16/Ki67 陽性病例的進展率和陰性進展率分別為30.8%和4.3%，顯著高于陰性病例的進展率，也同樣證實了P16/Ki67雙染檢測法對LSIL 病例轉歸具有預測作用。此外，也有很多研究表明，P16/Ki67雙染法對從LSIL 病例中篩出高級病變有較好的特異度。LIAO 等[32]表明P16/Ki-67 雙染可用于在低級別宮頸病變中診斷高級別病變，周小會等[33]在研究P16/Ki67雙染在LSIL病例中篩查出HSIL 病例的價值時指出，雖然雙染檢測法的靈敏度與陰性預測值只與高危型人乳頭瘤病毒(HR-HPV)檢測相當，但其特異度和陽性預測值顯著超過了HR-HPV檢測；歐洲一項納入了27 349例女性的研究[34]也同樣顯示P16/Ki67雙染在從LSIL 病例中檢出HSIL 病例有較高陽性預測值。可見P16/Ki67 聯合染色對預測LSIL 病變的轉歸以及從LSIL 病變中篩檢出高級別病變皆有較高的效能。

4 免疫組化染色檢測P16，Ki67表達在ASCUS中的應用

在宮頸細胞檢查中可經常觀察到非典型鱗狀細胞(atypical squamous cells of undetermined significance，ASCUS)，其細胞異常特征明顯多于炎性細胞改變，但數量和質量不足以診斷為CIN，故成為細胞學診斷中的灰區。ASCUS 病例惡變的頻率在1.6%和9.0%之間[35]，如果ASCUS 不能有效分流則會錯過最佳治療時機，病變可能會繼續發展到更高級別或鱗狀細胞癌。然而，ZHU 等[36]研究發現，在ASCUS中，CIN Ⅱ+僅占18.0%，CIN Ⅲ+僅占8.3%，且大多數ASCUS 是CIN Ⅰ或宮頸炎癥，如果所有ASCUS 患者接受陰道鏡檢查則會過度治療ASCUS。

目前針對檢測到ASCUS 的患者，臨床管理策略是從中分流出宮頸上皮內瘤變2 級及以上(CIN Ⅱ+)病變，主要采用HR-HPV檢測法，但此法存在特異度低、陽性預測值低等問題。國內外很多研究表明P16/Ki67雙染法比HR-HPV檢測法更能提高診斷的特異度，在ZHU 等[36]人的研究中，共有300例ASCUS 患者接受了宮頸組織病理學診斷，HPV-DNA 檢測總陽性率為85.3%，P16/Ki67 免疫細胞化學檢測陽性率為32.0%，說明用P16/Ki67雙染法代替HPV-DNA 檢測對ASCUS 進行分型，可使陰道鏡檢查的轉診率降低53.3%。有研究[37-39]在對ASCUS 患者進行分診時發現，P16/Ki67 對CIN II +的敏感度為86.36%，對CIN Ⅲ+的敏感度為83.33%，與 HR-HPV 相似，而P16/Ki67的特異度均高于HR-HPV，提示 P16/Ki67雙染檢測可作為我國宮頸癌篩查的有效方法。馬春華等[40]人研究雙染檢測法在ASCUS 的分流作用時發現，P16/Ki67雙染檢測法在檢測診斷 CIN Ⅱ和 CIN Ⅲ病變時靈敏度（陽性符合率) 達到了92%，特異度（陰性符合率)達到67.6%，雙染檢測結果與組織病理學結果符合率高。可見P16/Ki67雙染檢測能夠優化臨床醫師對ASCUS 患者的分層管理。

5 小結

綜上所述，目前大部分研究證實了檢測P16，Ki67 蛋白在宮頸上皮內病變中的表達對LSIL 病例的分流及預測轉歸具有意義；P16/Ki67 免疫組織化學雙染法對LSIL 病例和ASCUS 病例的分流有重要的臨床價值。P16 上皮彌漫陽性、Ki67 高表達提示為高級別鱗狀上皮內病變或鱗癌，在宮頸病變的診斷中，在形態學的基礎上，輔以P16，Ki67 免疫組化標記物檢測，幫助實現宮頸病變判讀、預測，促進臨床醫師對患者合理分流、分層管理。