食管腺癌動物模型建立方法的研究進展

吳柳盛，劉繼先，烏達，李小強1，，鄭于臻，羅瑞星，徐鵬程，吳定旺

(1.安徽醫科大學北大深圳醫院臨床學院，廣東 深圳 518036；2.北京大學深圳醫院胸外科，廣東 深圳 518036；3.安徽醫科大學，合肥 230032；4.中山大學附屬第六醫院胸外科，廣州 510655)

食管腺癌是一種常見的惡性腫瘤，多發于食管黏膜下層或賁門腺[1]，發病率僅次于食管鱗狀細胞癌，預后較差。近年來，食管腺癌的發病率和死亡率均逐漸升高，引起人們的廣泛關注。更多食管腺癌致癌因素的發現，促進了人們對食管腺癌的早期發現和診療進展，這對控制疾病死亡率起重要作用。食管腺癌患者術后化療中常存在抗腫瘤藥物的耐受情況，且腫瘤藥物耐受率不斷增加，給臨床治療帶來一定困難。因此，需要建立一個接近人類食管腺癌臨床特征的腫瘤動物模型來滿足這些條件[2-3]，同時對研究食管腺癌的發病機制以及抗腫瘤藥物耐受機制具有重要意義。但近年來食管腺癌動物模型只是從某單方面建模或建模方法描述不全面。現就不同類型食管腺癌動物模型的研究進展予以綜述。

1 食管腺癌不同手術方式建模

食管腺癌及癌前病變模型多采用外科手術反流法進行構建，其演變過程為反流性食管炎→Barrett食管→不典型增生→食管腺癌。常見的哺乳動物包括大鼠、小鼠、兔、犬、豬等。目前SD大鼠是食管腺癌動物模型最常用的建模對象，SD大鼠食管解剖大小理想，手術實施簡易方便，且SD大鼠對食管腺癌的敏感性高，在胃食管反流液的刺激下更利于誘導食管腺癌[4-5]。其他動物模型，如比格犬和豬[6]在食管腺癌研究領域也發揮重要作用，在組織結構和生理功能方面，比格犬和豬的食管與人類相似。該模型已被用于胃腸道營養的相關研究，但由于實驗成本較高和動物倫理學問題較少使用。

1.1食管-胃-十二指腸混合反流模型 食管-胃-十二指腸模型的形成機制主要是胃部和十二指腸部的酸性溶液反流侵蝕食管發生病變，是用于模擬人類食管癌變常用的動物模型。然而，由于缺乏轉基因的大鼠品系，該大鼠模型在機械和化學預防研究中的應用受到限制[7]。因此，食管腺癌模型以小鼠為主。有研究對實驗大鼠進行食管-胃-十二指腸吻合術，術后添加鐵劑喂養(鐵劑能促進誘發動物食管腺癌)，結果顯示，食管-胃-十二指腸吻合術后第3周和第11周，Barrett食管和食管腺癌誘導成功；術后第23周，Barrett食管的誘導率為58%，在第31周時提高至91%，而食管腺癌的誘導率分別為17%和73%[8]。在實驗中，食管-胃-十二指腸吻合模型最常見，且食管腺癌動物模型的誘導率較高[9]。因此，通過手術建立大鼠食管-十二指腸吻合模型有利于深入研究抗氧化損傷和預防食管腺癌，但臨床研究中較少應用。

1.2單純十二指腸液反流模型 十二指腸液反流模型主要用于堿性腸液侵蝕食管黏膜上皮細胞誘發癌變的研究。堿性的腸液對食管黏膜進行長期慢性腐蝕可誘發癌變。多項臨床研究發現，行胃大部切除術的患者隨訪10年后晚期并發癥中有部分患者出現食管下段腺癌，提示十二指腸液反流可能誘發食管下段腺上皮癌變[10-12]。Jiang等[13]采用手術建模的方式對40只大鼠進行胃大部切除術同時吻合食管和十二指腸，術后觀察大鼠食管下端腺上皮癌變率為54%。Choi等[14]和Walsh等[15]對術后大鼠進行解剖病理觀察和化生腺上皮細胞研究，發現大鼠食管下端化生的腺上皮可能源于食管干細胞，這為食管腺癌的發生機制研究提供了依據。但該建模方法操作困難，直接影響術后大鼠的成活率和建模成功率。

1.3單純胃液反流模型 單純胃液反流模型常以比格犬作為研究對象，通過對比格犬施行賁門擴張術，胃液反流會誘導黏膜腺細胞增殖，其組織病理活檢表現出早期食管炎和一些癌前病變的表型。張濤等[4]驗證了以上觀點，采用酸性的胃液長期侵蝕食管黏膜上皮致黏膜屏障受損，進而發生食管潰瘍出血、水腫狹窄以及癌前病變等，其中以Barrett食管發病率最顯著。動物實驗中小鼠受損的食管黏膜出現水腫潰瘍、增生以及贅生物的形成，管腔狹窄、管壁變厚等肉眼可觀病理表現。通過手術來構建胃食管反流模型誘導食管腺癌較常見[16]，但特異性差，觀察時間長，較少應用。

1.4食管灌注動物模型 食管灌注動物模型指通過人造食管導管置于動物體內，灌注酸性液體來模擬胃酸反流，通過酸性液體對食管腺上皮的不斷刺激和損害來誘導食管腺癌模型的構建。這種食管灌注動物模型實驗對象有家兔、大鼠、小鼠等[17]。皮下植入大鼠滲透壓微泵的灌注模型可以精確控制灌注的濃度和流量[18]。因此，一些學者針對不同的實驗對象建立了食管灌注模型，結果發現酸性液體會直接造成食管黏膜腺上皮損傷，進而誘導食管腺上皮發生癌變[19]。該建模方法在實驗中較少應用，屬于自然性誘發動物的食管發生癌變，外部影響因素多，誘發時間較長，不適合短期研究。

2 食管腺癌不同藥物建模

目前化學致癌劑(以亞硝胺類為代表)誘導食管腺癌動物模型的技術趨向成熟和完善，常用甲基芐基亞硝胺(nitrcxsomethylbenzylamine，NMBA)作為致癌劑。國外文獻報道，NMBA是誘發動物食管腺癌較為理想的化學制劑，對食管有較高的親和性和特異性[20-21]。其優點是誘導的動物食管腺癌病理特性與人食管腺癌細胞的發生順序相平行，藥物劑量較小，毒性較弱，該類動物模型操作簡易。亞硝胺類物質構建食管腺癌模型的給藥方式包括自由取食法、食管內灌注及皮下注射法。亞硝胺建模方式的癌變誘發率高，該類動物模型可以用來研究食管腺癌的發病機制和臨床預后療效評估。同時該類建模技術特異性差[22]，目前化學試劑誘癌模型還存在諸多限制，如誘癌成功率低，建模時間長，不同物種和個體間腫瘤的差異較大，所表現出來的腫瘤形態特征多樣，不適宜作為臨床腫瘤藥物治療的動物模型研究。在藥物誘發的食管腺癌模型中，實驗動物與致癌因子直接或間接接觸。該建模方式操作簡便，腫瘤誘發率高，動物成瘤效果好，可肉眼觀察到整個食管黏膜發生癌變的病理過程。

2.1NMBA喂養法 亞硝胺是強致癌物，也是最重要的化學致癌物之一。NMBA是亞硝胺的種類之一，消化系統腫瘤(如食管癌)的發生與飲食中亞硝胺的攝入量相關。鄒麗輝[23]采用NMBA灌喂SD大鼠的建模方式成功誘導了食管腺癌，選取3～4周齡體重約80 g的大鼠，每5只一組，NMBA儲存液用蒸餾水稀釋，使用溶度為200 μg/mL，劑量為1 mg/kg，每周連續灌喂3次，持續3個月，其中半個月后，每一個月處死5只大鼠，誘癌及收集標本時間為38周，整理SD大鼠食管病理組織活檢報告發現食管炎→不典型增生→原位癌→腺癌的動態病理變化過程。NMBA喂養法是化學致癌物誘導食管腺癌動物模型構建領域中最常用的一種方法，具有操作簡便、成本較低、實驗偏差較小、可行性高等優勢[24-25]。

2.2對甲基戊基亞硝胺喂養法 對甲基戊基亞硝胺是亞硝胺中的一種常見亞型，常用作化學致癌劑誘發癌變，進而構建相對應的腫瘤模型。鄒晴晴等[26]將對甲基戊基亞硝胺作為大鼠(MRC-Wistar品系)食管腺癌的誘變劑，藥物劑量為12.5～25 mg/kg，每周給藥1次，給藥周期持續12周，并持續給予大鼠飲水17～20周，后期處死大鼠并進行病理切片處理和蘇木精-伊紅染色，病理結果顯示食管、鼻腔和肺部組織出現乳頭狀瘤、癌前病變和浸潤癌變，表明癌變誘發率較高，病理變化與人類相似。對甲基戊基亞硝胺喂養法在食管腺癌動物建模的基礎研究中也是較為常用的一種方式，動物建模成功率較高，實驗周期較短，可節省大量時間和成本[27-28]。

2.34-硝基喹啉-1-氧化物(4-nitroquinoline-1-oxide,4-NQO)喂養方法 4-NQO是一種水溶性喹啉衍生物[29]，最初是應用于誘導動物口腔癌模型的化學致癌物。有研究表明，4-NQO也能誘導小鼠(NOD/SCID品系)發生食管腺癌，且致癌率較高，建模效果好[30]。但4-NQO喂養模型的藥物劑量大，誘癌周期時間長，毒性大，成本高，特異性較差，致癌物質常會誘導其他器官發生癌變，實驗偏差大，目前較少應用。Abdel-Rahman等[31]將105只C57BL/6小鼠隨機分為3組，分別用100、50、10 μg/mL的4-NQO溶液供小鼠自由飲用，實驗過程中發現劑量為100 μg/mL組的小鼠不良反應最明顯，在32周病變進一步發展，出現明顯的原位癌和進展期食管腺癌病理表現。在誘導食管腺體發生癌變過程中，隨著4-NQO濃度升高，食管腺癌發生率也升高。但在4-NQO所構建的腫瘤動物模型也存在一定的局限性，即小鼠自由飲用4-NQO溶液，無法確定每只小鼠具體的4-NQO暴露劑量[32]。

3 食管腺癌不同移植建模

移植腫瘤的動物模型被廣泛應用，且是篩選和研究新的抗腫瘤藥物的最常用模型。這種移植方法介于細胞培養和小鼠腫瘤模型之間，稱為“動物培養”。移植性的動物模型構建有同種移植和異種移植兩種方式。但同種移植食管癌動物模型能獲得的鼠食管癌細胞系較少，其應用受到一定限制[33]。異種移植食管癌動物模型是最常用的食管癌動物模型之一，該模型具有較高的腫瘤形成率，并可以反映腫瘤侵襲、生長和藥物敏感性的特征。移植的食管腺癌動物模型可以模擬人體內的腫瘤微環境，研究人體內食管腺癌的發生和進展[34]。早期的研究大多使用異位移植模型[35]，其具有制備成功率高和腫瘤形成快的優點，但經常發生浸潤和轉移，從而限制了進一步的研究應用。

3.1細胞系建立的食管腺癌動物模型 腫瘤細胞系的同種異體動物模型在細胞毒性藥物的研發中發揮重要作用。其優點是接種特定腫瘤細胞可以誘導同種異體腫瘤，生長速度相對一致，個體差異小，接種存活率接近100%，容易客觀地判斷療效，可以連續移植到同一只動物中，且保留時間長，實驗周期短[36]。常用于食管腺癌的細胞株包括EC109、KYSE510、Casel7等[37]，各細胞株來源不同，所以增殖、侵襲、轉移及基因水平均不同。相關研究報道[38-39]，多數的食管腺癌細胞系經過體外多代傳遞培養后，細胞系可能會出現突變情況，其組織學特征不穩定，無法還原和體現之前食管腺癌患者的多樣性和個體化，因此在食管腺癌機制研究中的應用受限。

3.2免疫缺陷食管腺癌小鼠模型 因正常小鼠對腫瘤存在免疫排斥反應，造成腫瘤在普通小鼠上種植的成功率不高，因此對于腫瘤動物模型的構建需要專門的免疫缺陷小鼠作為載體。Abdel-Rahman等[31]首次成功建立食管腺癌腫瘤組織移植模型，高度還原了腫瘤在體外培養的動態發展環境，目前仍是前沿的腫瘤動物模型技術。Ceylan等[32]和Schellnegger 等[33]首先使用人食管腺癌細胞系成功建立小鼠皮下異種移植腫瘤。免疫缺陷食管腺癌小鼠模型可高度模擬食管腺癌患者腫瘤細胞的生長環境，但不同個體間對抗腫瘤藥物的敏感性和耐受性存在差異，這種方法可以有效避免臨床上食管腺癌患者的個體差異[40]。同時醫務工作者還可以利用該模型進行抗腫瘤藥物試驗，患者評估療效后再接受靶向治療，可以制訂出有前瞻性和預見性的治療方案，改善患者的生活質量并延長其生存時間。

3.3人源化食管腺癌小鼠模型 近年來隨著腫瘤免疫治療研究的快速發展，腫瘤免疫浸潤也成為研究熱點。人源化小鼠模型是指攜帶有功能性的人類基因，能體現出人類腫瘤微環境特征的小鼠模型[41]。有研究報道，食管腺癌裸鼠模型病變特征與人類相似，近交系組織相容性好，腫瘤移植效果較佳，可用于篩選抗腫瘤藥物以及進行腫瘤耐藥機制學研究[42]。Ceylan等[32]利用移植的手段將人體食管腺癌細胞或組織接種于動物體內建立食管腺癌的動物模型，并通過異種移植將食管腺癌組織或癌細胞植入除食管外的實驗動物的其他部位。

3.4基因工程食管腺癌小鼠模型 隨著人們對基因工程和生物技術研究的深入，食管腺癌內源性的發生機制研究成為人們關注的熱點。Matsumoto等[34]第一次通過將純化的DNA與小鼠胚胎原核相結合，成功獲得了轉基因動物。隨著基因編輯技術(CRISPR/Cas9)的發展，現已形成一套成熟的基因工程技術體系[35]。基因工程小鼠模型對現代癌癥研究具有重要意義，為腫瘤治療提供了個性化診療方案和思路，同時為基因工程的轉基因小鼠提供了一個可預測的模型，用來測試癌基因是否可以導致生物體內正常細胞在正常情況下致癌，基因工程食管腺癌動物模型是研究食管腺癌內在因素的最佳選擇。

4 體內外腫瘤動物模型前沿技術

免疫熒光成像技術是目前腫瘤分子生物學研究中常用的影像學輔助技術。在腫瘤動物模型的構建中，這種活體成像技術能夠通過無創的方式動態觀察體內成瘤情況，包括大小、位置以及腫瘤侵犯范圍等，大大節省了實驗時間和成本，有利于提高科研效率。Lee等[36]的研究方向是目前腫瘤動物模型構建的最前沿技術——可視化原位人源腫瘤模型[37]構建。可視化原位人源腫瘤模型通過對SD大鼠進行腫瘤細胞的原位皮下移植，最大限度地還原患者機體內腫瘤的動態環境變化，后期通過綠色熒光蛋白/熒光素酶成像技術呈現其發展趨勢[23]。該模型的構建極大地推動了臨床腫瘤的個性化治療和精準治療，特別是食管腺癌術后化療中不同個體對抗腫瘤藥物耐受機制的研究[43]。柏文等[12]使用無創生物體內成像方法監測食管腺癌裸鼠腫瘤模型，并成功構建了綠色熒光蛋白/熒光素酶雙標記人食管腺癌ECA109細胞系(ECA109-熒光素酶-綠色熒光蛋白)，其原理是采用動物活體成像技術觀察食管腺癌細胞在動物模型中的生長和轉移。Chen等[39]提出將綠色熒光蛋白/熒光素酶雙重標記技術用于體內成像監測，這結合了兩種成像技術的優勢，擴大了體內成像的應用范圍。此外，綠色熒光蛋白/熒光素酶雙重標記技術與體內成像技術相結合，在食管腺癌的裸鼠腫瘤模型上進行動態觀察研究[40]，以可視化了解食管腺癌細胞的生物學行為和特征。這種活體成像技術為食管腺癌治療藥物的研發、腫瘤耐藥性和基因治療效果驗證等提供了新思路。

5 小 結

隨著近年來免疫工程和基因工程的快速發展，腫瘤動物模型的構建技術越來越成熟。腫瘤動物模型從早期的化學致癌劑亞硝胺類毒物誘發動物食管腺癌模型的形成到目前的可視化原位人源腫瘤模型的成功構建，更加精準地模擬腫瘤在人體內生長環境，隨著相關技術的成熟和發展，腫瘤動物模型的構建更加個性化、更有針對性、更加精準化。對食管腺癌腫瘤動物模型構建并進行活體的動態示蹤[42-43]，清晰了解食管腺癌動態的生物學行為，能夠快速、精準、個性化地建立理想的腫瘤動物模型，可為食管腺癌抗癌藥物的研發、臨床診斷和治療以及預后評估等提供新思路。實驗動物人源化[44]是近年的研究熱點，期望通過人源化實驗動物來構建腫瘤動物模型，在一定程度上高度還原腫瘤的生長環境。