冬凌草甲素提取工藝的研究進展

郝 楠，郭 杰，陶 蕾

（蘭州職業技術學院，甘肅 蘭州 730070）

1 冬凌草甲素構造修飾與抗癌活性

首先，是C（1）位（和）C（14）修飾。冬凌草甲素的結構修飾位點很多，對C（1）-OH與C（14）-OH修飾是常使用的修飾模式之一，最簡易的C（1）-OH與C（14）-OH修飾是使用這兩大位點羥基活性的差別，通過氧化或和酰氯、酸酐等化學反應完成修飾（Scheme 1）。比如冬凌草甲素直接C（14）位羥基乙酰化，得到化學物14-乙酰冬凌草甲素（2），通過C（1）位、C（14）位羥基雙乙酰獲得1,14-雙乙?；璨菁姿兀?）等。

在簡易修飾的前提下進行深度修飾是常規的模式，一般以兩類模式呈現：首先，是通過冬凌草甲素或其派生物的C（14）羥基與含羥基的1結構通過酯鍵相連（Scheme 2的的路徑A）；其次，是通過環形酸酐在在冬凌草甲素或其派生物的C（14）位先引進一個羧基，再通過新引進的羧基與含羥基或氨基的結構以酯鍵或酰胺鍵相連（Scheme2的路徑B）。

冬凌草甲素較高級別的C（14）位修飾是在C（14）-OH以路徑A的模式引進相異功能的基團與藥成分，以構成糅合體，通過協同效應應用于癌癥的救治中，呋咱氨氮藥物是NO供體，通過巰基還原排放氣態物分子NO。NO在生理診療方面有著多類功能，例如抗癌癥、抗炎癥、靜脈舒張等。對類巨噬細胞U937，NO通過調節自噬與催化NF-κB-COX-2-IL-1β的模式誘導冬凌草甲素引導自噬所強化的胞葬功能。所以，將冬凌草甲素與NO供體雜糅成一類新式的抗癌化學物是可行的。鑒于這種方略，Li等以路徑A模式在冬凌草甲素或其派生物C（14）位引進呋咱氮氧成分，獲得化學物15a～15i、16a～16i與17a～17i。所得到的冬凌草甲素呋咱氮氧化學混合物在體外60min可以釋放較高質量的NO，化合物15a～15i、16a～16i與17a～17i相較于冬凌草甲素（1）與1-氧代-冬凌草甲素（5），對四類癌癥細胞（K562、Bel-7402、MGC-803、Ca Es-17）都有了較強的抗增值活性，其抗增殖活性與NO釋放有關——NO釋放量大，抗增殖性就越佳。當中化合物作用15 h時抗癌活性最佳，其對K562細胞IC50是1.82·mol/L，對MGC-803細胞的IC50是1.81·mol/L，對Bel-7402細胞的IC50是0.86·mol/L。

2 冬凌草作用機制問題

針對冬凌草甲素作用機制不確定的問題，還能夠在C（14）位引進熒光基團制備成冬凌草甲素的熒光探針進行冬凌草甲素作用機制的研究。例如，Xu等使用模式設計制備了很多該種類化合物26a-26e、27a-27c，其中化合物作用26 d效果最好，此化合物能夠被腫瘤細胞迅速攝入，通常定位在線粒體，通過該模式佐證研究細胞色素C在冬凌草甲素誘導的線粒體介導調亡中有著極大意義。

3 冬凌草提取工藝與工藝優化論述

3.1 冬凌草甲素比例測試

3.1.1 測試波長

精密稱取冬凌草甲素適度溶于95%乙醇中，定量稀釋為30 mg/L試液。以95%乙醇為空白做對照，于200～400 nm波長范疇內完成紫外線掃描。

結果表明，此成分在238 nm波長范疇內基本上被完全吸納，那么挑選其作為測試波長是可行的。

3.1.2 色譜環境

Diamonsil C18色 譜 柱（250 mm×4.6 mm，5μm）；流動相甲醇—水分（55∶45）；測試波長是238 nm；體積流量1.0 mL/min；柱溫室溫；進樣量20μL。在以上色譜環境中，冬凌草甲素保存用時是8.5 min，其色譜峰與鄰近物質的離析度較好。

3.1.3 標準曲線描繪

稱取冬凌草甲素參照物10.0 mg，用95%的乙醇定容到50 mL，搖晃均勻，可以獲得200.00 mg/L參照物標液。精密量適度，用甲醇-水（55∶45）定容到10 mL，搖晃均勻，獲得0.0 mg/L、20.0 mg/L、40.0 mg/L、60.0 mg/L、80.0 mg/L的標準系列應用液。以峰面積為縱坐標（Y），以標準系列應用液濃度為橫坐標（X）繪制標準曲線，獲得回歸方程Y=24 562X-32 289（R=0.999 6），在10.0～80.0 mg/L范疇內線性反應最佳。

3.1.4 提取工藝優化

冬凌草是一類資源充裕的藥食兩用的植被資源，是開發保健食品的理想原料，為高效使用，目前對其活性成分的提煉萃取藥理學進行深入研究，并進行開發制備及加工轉化商品工作。使用超高壓提煉冬凌草甲素的優化統一條件是固液比達到1∶22、乙醇濃度達到75%、UHP用時4 min與UGP壓力達到320 MPa，甲素提取比例是0.322%，有著極大的發展潛能。

邁入21世紀以后，國際腫瘤病學界與新藥研究部門對冬凌草的抗癌功能極為重視，從全株植被分離獲得二萜類化合物、一些三萜、甾體、黃酮、生物堿、揮發油、氨基酸、有機酸及其他類化學物。藥理研究表明，很多成分有著抗腫瘤功能、抗氧化功能、抗菌消炎、降血糖、抗突變、免疫等功能。研究表明，冬凌草中的三萜類成分熊果酸對多類惡性腫瘤細胞有抗增殖的效果。所以提取冬凌草中的熊果酸成分，對研發新藥與保健食品有著巨大的市場意義。目前對冬凌草內冬凌草甲素等二萜類化合物提取研究很多，然而關于冬凌草內熊果酸的提取研究進展較慢，袁珂使用超臨界的二氧化碳技術提取冬凌草中的熊果酸，得率極高。

3.1.5 冬凌草優化提取工藝的對比

中藥有效成分的傳統提取模式通常使用煎煮與回流提取工藝。目前超臨界流體提煉、超聲場強化、微波輔助等當代分離技術也開始在中藥活性成分的提煉工作中使用。與傳統模式對比，使用當代分離技術的提取工藝有著生產效果好、速率快、消耗小的特征。

冬凌草有著明顯的抑菌活性，是抑制食物腐蝕與病菌的優質資源。除Escherichia coli外，冬凌草乙醇提取物的抑菌圈內徑都比山梨酸要大。冬凌草乙醇提取物對Staphylococcus aureus等4類常規的食物腐蝕病菌均有明顯的抑制效果，有著成為天然食物防腐劑的潛能。

當前，冬凌草抑菌活性成分的提取工藝通常使用水提與醇提的傳統工藝。

而用當代分離技術來提取冬凌草抑菌活性成分是在傳統的乙醇回流提取冬凌草抑菌活性成分工藝的基礎上以超聲場進行強化，通過與乙醇回流提取與超聲提取的功效進行比較，結果表明，超聲輔助乙醇回流提取工藝比乙醇回流提取工藝與超聲提取工藝效果更好，其抑菌圈內徑增加到21.63 mm。并且，與直接用乙醇回流提取工藝相對比，超聲輔助乙醇回流提取工藝的提取用時從2 h減少到30 min。使用超聲輔助乙醇回流提取冬凌草抑菌活性成分是節省成本的模式，即有助于減少提取流程中的消耗，節省用時并且有助于節省溶液。

4 結語

綜上所述，由于冬凌草甲素對熱不穩定，可以適度使用提取迅速、溫度偏低的超聲提取，該模式成本偏低，試液內雜物色素很少，有助于后期純化。并且，其影響因素通常是提取用時、提取氣溫、液料比等，相對容易管控，重復性強，運用柱層析融合重結晶法來純化冬凌草甲素有著極強的可操作性。