疏乳消結顆粒的成型工藝

高粉梅 于 博 潘新波 王 信 趙麗娟 吳 晶 賈 忠，*

1.甘肅農業大學,甘肅 蘭州 734000；2.蘭州市第二人民醫院，甘肅 蘭州 730046；3.蘭州市中醫醫院，甘肅 蘭州 730050

乳腺增生屬于中醫學“乳癖”范疇，是中年婦女的一種常見的非炎癥性疾病，以乳房腫塊和乳房脹痛為主要臨床表現，其發病率占乳腺疾病的首位，有癌變之潛能[1]。隨著生活水平的提高，工作節奏的加快，自然環境和社會環境的變化，競爭意識的增強以及飲食結構的改變，其發病率有逐年升高的趨勢[2]。因此提高本病的藥物治療療效，對預防乳腺癌的發生有重要意義。

疏乳消結顆粒是蘭州市第二人民醫院的經驗方，是以乳核內消方為基礎的加減方，由柴胡、茜草、夏枯草、赤芍、青皮、甘草、絲瓜絡、郁金、香附、橘核、當歸、山慈菇12味藥材配伍而成，具有疏肝活血、疏肝散結的功效[3]。臨床應用于治療乳腺小葉增生病，癥見乳房腫脹，有腫塊，月經前癥狀明顯，經至又見好轉。臨床應用中除了治療乳腺小葉增生病外，對治療痛經及黃褐斑有明顯的功效[4]。

1 儀器與材料

1.1 儀器 島津LC-10AVP高效液相色說譜儀(包括SPD-10AVP二極管陣列檢測器，LC-10AT二元泵，C-R10A色譜工作站)；FA2004N電子天平(上海精密科學儀器有限公司)；HX-12型電熱真空干燥箱(重慶市大足醫用設備廠)；CQX25-12超聲波提取器(上海必能信超有限公司)；PDA紫外檢測器(日本島津公司)；HH-8恒溫水浴鍋(江蘇省金壇市環宇可約儀器廠)。

1.2 材料 芍藥苷(批號：110736-201136)、迷迭香酸(批號：R0200-50MG)均購自中國食品藥品檢定研究所；實驗藥材均購自蘭州安泰堂中藥飲片有限公司，由蘭州大學馬志剛教授鑒定；甲醇、乙腈為色譜純；β-環糊精、可溶性淀粉、乳糖、糊精、蔗糖、微晶纖維素均購自甘肅恒鏈業生物有限公司。水為蒸餾水，其余均為分析純。

2 方法與結果

2.1 疏乳消結顆粒的制備 本研究通過分析組方中各藥材有效成分的理化性質，采用Box-Behnken實驗進行水煎煮提取。12味藥材進行水煎煮提取。將所得干膏浸粉加入相應輔料，輔料比為浸膏∶可溶性淀粉∶乳糖∶糊精=1∶0.75∶0.25∶0.75。干膏浸粉，輔料，混合均勻加入60%乙醇制成手捏成團，壓之即化的軟材，于105 ℃下烘干1 h，過篩，收集能過1號篩不能過5號篩的顆粒[5]。

2.2 制備工藝研究

2.2.1 制劑工藝指標 疏乳消結顆粒在前期研究中發現，芍藥苷、迷迭香酸的含量在整個研究過程中較穩定，因此在本實驗中將疏乳消結顆粒的浸膏得率，芍藥苷含量以及迷迭香酸含量的綜合指標作為提取工藝的指標[6]。將每個指標均標準化為 0～1之間的歸一值，采用 Hassan 法對指標分別進行數學轉換，計算歸一值(di)=(Yi-Ymin) /(Ymax-Ymin) 。式中，Yi 為實測值， Ymin和 Ymax為每一指標在不同次試驗中測得的所有值中的最小值和最大值。對各指標的 di 按“OD = ( d1 × d2 … × dn)1 /n”求得幾何平均數[7]，即得總評歸一值(OD) 。

2.2.2 色譜條件 色譜柱：Diamonsil 5 μm C18(2)250×4.6 mm；流動相：以乙腈為流動相 A，以 0.1%磷酸溶液為流動相 B；梯度洗脫：0～10 min，A-B(10∶90)，10～30 min，A-B(90∶10)，30～45 min，A-B(10∶90)；流速 1.0 mL/min；柱溫室溫[8]；進樣量20 μL；檢測波長：253 nm；理論塔板數按對照品芍藥苷、迷迭香酸計算分別不低于3000。

2.2.3 溶液的配制 精密稱定疏乳消結顆粒1 g，置250 mL容量瓶中，加入50%乙醇溶液約 100 mL，稱定重量，超聲處理(功率300 W，頻率50 kHz)30 min，放冷，再稱定重量，用30%甲醇補足減失的重量，搖勻，濾過，取續濾液再經0.45 μm微孔濾膜過濾后，即得[9]。

精密稱取五氧化二磷真空干燥12 h的芍藥苷，迷迭香酸對照品，加甲醇制成濃度分別為210、208 μg/mL的混合溶液。精密吸取上述制備的溶液各20 μL，按照色譜條件注入色譜儀。結果如圖1所示。

1.芍藥苷；2.迷迭香酸；A.混合對照品溶液；B.供試品溶液圖1 高效液相色譜圖

2.2.4 線性關系的考察 分別精密吸取“2.2.3條件下的混合對照品溶液2、4、6、10、20 μL，按“2.2.2”項下色譜條件下進樣，以進樣量為橫坐標，色譜峰面積為縱坐標，繪制標準曲線，得線性回歸方程：芍藥苷Y=3468.7X+3609.1(R=0.9996);迷迭香酸Y=995.11X+1379(R=0.9991)。結果表明，芍藥苷，迷迭香酸含量分別在10.5～210、10.4～208 μg范圍內線性關系良好。

2.2.5 精密度實驗 精密吸取“2.2.3”條件下的混合對照品溶液各20 μL連續進樣6次，記錄峰面積，計算含量，結果芍藥苷，迷迭香酸含量RSD分別為0.89%，1.57%。結果表明機器精密度良好。

2.2.6 重復性實驗 稱取同一批號(20200703)疏乳消結顆粒6份，按“2.1”方法制備，在“2.2.2”條件下進樣測定。結果顯示，6份疏乳消結顆粒中芍藥苷，迷迭香酸RSD 分別為0.87%，1.63%，結果表明該方法重復性良好，符合分析測試要求。

2.2.7 穩定性實驗 取同一供試品溶液，室溫下分別于0、2、4、8、15、24 h進行測定，結果芍藥苷，迷迭香酸含量RSD分別為2.13%，0.87%。

2.2.8 加樣回收率 實驗精密稱取已知含量的同一批樣品(批號：20200703)0.2 g，加入芍藥苷(0.058 mg/mL)1 mL，迷迭香酸(0.22 mg/mL)1mL，制成供試品溶液，精密吸取6份供試品溶液，注入高效液相色譜儀。芍藥苷平均加樣回收率為99.54%，RSD=0.47%，迷迭香酸平均加樣回收率為99.81%，RSD=1.14% (n=6)。

2.2.9 Box-Behnken優化設計 采用Design-Expert8.0.6軟件中的Box-Behnken試驗設計方案，選取提取時間(A)，加水量(B)，提取次數(C) 作為影響因素[10]，以芍藥苷、迷迭香酸含量及浸膏得率的綜合指標為觀察指標，設計實驗。因素水平及結果見表1、表2。

表1 因素與水平

表2 Box-Behnken實驗結果

2.2.10 模型擬合與方差分析 采用Design Expert8.0.6軟件處理數據，以浸膏得率為評價指標進行二項式擬合，得到回歸方程R=18.04+0.46A-0.16B+4.72C-0.13AB+020AC-1.21BC-0.81A2+0.49B2-0.61C2(R=0.9737)。結果表明，多元二次方程相關系數較高，擬合效果較好。采用ANOVA分析回歸參數，由表3可知，二項回歸方程失擬項沒有顯著差異，擬合項差異極顯著，說明該回歸方程可以對任何條件下的提取工藝進行預測。三維響應曲面圖如圖2所示。

表3 方差分析

表3 方差分析

圖2 各因素對OD值的響應曲面圖

利用Design Expert8.6.1軟件擬合結果顯示最優工藝為加8倍量水，煎煮3次，每次60.52 min,考慮到實際情況，將提取工藝條件定為加8倍量水，煎煮3次，每次70 min。

2.2.11 驗證試驗 按照Box-Behnken試驗優選出的最佳制備工藝參數生產 3 批疏乳消結顆粒顆粒(批號：202004，202005，202006)，進行驗證實驗，與預測值的偏差為 0.0031%，偏差較小，表明所選工藝穩定性好，可信度高。結果見表4。

2.3 輔料選擇

2.3.1 輔料種類的篩選 以顆粒制劑常用的輔料可溶性淀粉，乳糖，糊精，蔗糖，微晶纖維素為考察對象。分別于已制得的浸膏按1∶1的比例混勻，干法制粒，并測定吸濕率，優選出防潮效果好、經濟且實惠的輔料[11]。5種輔料吸濕結果見表5。

表4 工藝驗證結果

表5 五種輔料吸濕比例表

從上表中可以看出，五種輔料的吸濕率：可溶性粉淀粉>乳糖>糊精>蔗糖>微晶纖維素。考慮到經濟與口感等問題，研究中選用乳糖，可溶性淀粉，糊精3種輔料聯合配用作為本實驗中顆粒劑的輔料。

2.3.2 輔料配比的選擇 按照上述實驗方法優選出防潮效果較優的輔料，考慮3種輔料連用以降低制劑成本與輔料用量。實驗以吸濕率，成型率，休止角為考察對象，篩選適宜的輔料用量比。

綜合得分計算方法如下：①一次成型率分值=實驗一次成型率/最大一次成型率；吸濕率=(吸濕后浸膏粉質量-吸濕前浸膏粉質量)/吸濕前浸膏粉質量×100%；休止角分值=1/(實驗休止角/最大休止角)。②綜合得分=一次成型率分值×40+吸濕分值×30+休止角分值×30[12]。

表6 因素水平表

表7 正交實驗設計及結果

2.3.3 正交實驗結果 由表8方差分析結果可以看出，糊精，乳糖，可溶性淀粉與浸膏的比值均沒有顯著影響，得到最佳工藝條件為糊精∶浸膏=0.75∶1，乳糖：浸膏=0.25∶1，可溶性淀粉∶浸膏=0.75∶1。

2.3.4 驗證試驗 按優選的最佳條件進行3次驗證試驗，糊精∶浸膏=0.75∶1，乳糖∶浸膏=0.25∶1，可溶性淀粉∶浸膏=0.75∶1。結果見表9。表明該工藝穩定可行。

表8 方差分析

表9 驗證實驗

3 討論

疏乳消結顆粒遵循“肝欲散，急食辛以散之”之要，以疏肝理氣為主，活血散結為輔，使肝郁得疏，血瘀得化，結癖得散；補肝體，助肝用，體用同治[13]；理氣養血活血，氣血兼顧；疏通乳絡，軟堅散結。前期試驗發現疏乳消結顆粒適合用水提取。因此選取提取時間，加水倍數，提取次數3個影響因素，基于Box-Behnken試驗，以綜合測評法優選出疏乳消結顆粒的最佳提取工藝。試驗結果表明，最佳提取工藝為加8倍量水，提取3次，每次70 min。在前期試驗發現，加水倍數并不能影響提取率、芍藥苷及迷迭香酸的含量，而隨著提取時間與次數的增加，浸膏得率、芍藥苷及迷迭香酸的含量也隨著增加。在后面的驗證實驗中也證實了這一點。因此，選擇加8倍量水，提取3次，每次提取時間為70 min的最佳提取工藝。

疏乳消結顆粒浸膏粉吸濕性較強，直接制粒有很大的困難。選擇臨床常用的幾種輔料，選出適合疏乳消結顆粒的輔料。經測定發現可溶性淀粉，乳糖，糊精3種輔料與疏乳消結顆粒浸膏粉合用能夠大大提高疏乳消結顆粒的抗潮效果。考慮到經濟等各種因素，選擇這3種輔料連用。采用正交實驗優選輔料的最佳配比，以成型率、休止角及堆密度的綜合評分為考察指標，優選出最佳配比為浸膏∶可溶性淀粉∶乳糖∶糊精=1∶0.75∶0.25∶0.75。

研究采用多指標綜合測評法為保證疏乳消結顆粒提取與輔料添加的客觀準確性。浸膏得率、芍藥苷及迷迭香酸含量考察了疏乳消結顆粒的提取工藝。以成型率、休止角及堆密度為指標考察了輔料配比的最優工藝，全面考察了輔料種類及用量對顆粒成型的影響。本研究中疏乳消結顆粒的成型工藝研究較為全面，可以為疏乳消結顆粒的制備工藝提供參考。