復方苦參注射液總糖純化方法及含量測定研究

王洪玲 段秀梅 海麗娜 秦文杰 王鵬飛 畢小鳳 張亞錳

北京振東光明藥物研究院有限公司，北京 100120

復方苦參注射液是由苦參和白土苓經現代科學方法精制而成的中藥注射液，具有清熱利濕、涼血解毒、散結止痛的功效，用于癌腫疼痛、出血[1]。迄今為止，復方苦參注射液的研究主要集中在生物堿及黃酮類成分[2]，對于糖類物質的研究相對較少。近年來，中藥糖類作為一類生物活性成分，具有免疫調節[3]、抗腫瘤[4]、抗氧化[5]、降血糖[6]、抗肺癌[7]等多種功能，已成為研究的熱點。本研究對復方苦參注射液總糖純化方法進行優選，測定方法進行驗證，為復方苦參注射液再評價提供參考。

1 儀器與材料

1.1 儀器 Agilent Cary60紫外可見分光光度計；T9北京普析紫外可見分光光度計；XSE 205 DU分析天平(METTLER TOLEDO)；TLE 204/02分析天平(METTLER TOLEDO)；HH-6D1恒溫水浴鍋(常州市美特儀器有限公司)；Mill-Q 超純水制備系統(Millipore公司)。

1.2 材料 大孔吸附樹脂(HPD100、AB-8、D 101，天津市光復精細化工研究所)，濃硫酸(批號：20180428，北京化工廠)；乙醇(批號：20161128，北京化工廠)；苯酚(批號：C1927002，北京益利精細化學品有限公司)；碳酸氫鈉(批號：20171104，阿拉丁化學試劑有限公司)；D-無水葡萄糖(批號：110833-201707，中國食品藥品檢定研究院)；復方苦參注射液(批號：20171102、20171128、20180301、20161032、20181203、20181204、20181209、20181212、20181213、20181214、20181215、20181138、20181139、20181034，山西振東制藥股份有限公司)。所用試劑均為分析純，實驗用水均為Millipore 超純水制備系統下制備的純化水。

2 方法與結果

2.1 溶液制備

2.1.1 葡萄糖對照品溶液制備 精密稱取D-無水葡萄糖適量，加水溶解，配成1 mg/mL的對照品標準品溶液，備用。

2.1.2 5%苯酚溶液的制備 稱取苯酚100 g，加碳酸氫鈉0.05 g，置于250 mL圓底燒瓶中，常壓蒸餾，接收180 ℃餾分，用包覆鋁箔的三角瓶收集，放置陰涼干燥處，備用；稱取此餾分苯酚5 g，加水溶解，轉移至100 mL棕色量瓶中，用水稀釋至刻度，搖勻，即得5%苯酚溶液，備用[8]。

2.1.3 供試品溶液制備 精密量取復方苦參注射液10 mL至50 mL量瓶中，用水稀釋刻度，搖勻，精密量取稀釋液5 mL進行上樣，用水洗脫，洗脫流速為0.566 mL/cm2·min，用量為3BV，收集濾出液至 100 mL 量瓶中，用水稀釋至刻度，精密量取1 mL至10 mL量瓶中，用水稀釋至刻度，搖勻，備用。

2.2 檢測波長選擇 取樣品溶液及對照品稀釋溶液(濃度約為60 μg/mL)各1.0 mL，分別置于15 mL具塞試管中，依次加入5%苯酚溶液 1.0 mL，充分振搖后迅速加入濃硫酸5 mL，振搖，迅速移至 80 ℃ 水浴中保溫10 min，冰浴中冷卻3 min，于紫外分光光度計在190～800 nm下進行全波長掃描。

2.3 樣品檢測方法 精密量取樣品溶液1.0 mL，空白取1.0 mL蒸餾水，分別置15 mL具塞試管中，依次加入5%苯酚溶液 1.0 mL，充分振搖后迅速加入濃硫酸5 mL，振搖，迅速移至 80 ℃水浴中保溫 10 min，冰浴中冷卻3 min，于487 nm處測定其吸光度，并根據標準曲線計算樣品含量。

2.4 樣品純化方法確定

2.4.1 直接稀釋法樣品制備 分別精密量取復方苦參注射液(20171128、20180301、20161032)各1 mL，至1000 mL量瓶中，用水稀釋至刻度，搖勻，即得。

2.4.2 大孔吸附樹脂純化樣品 分別精密量取復方苦參注射液(20171128、20180301、20161032)各1 mL，按2.1.3項下方法進行樣品制備，按2.3項下方法進行檢測。結果見下表1。

表1 不同檢測方法結果對比表

大孔吸附樹脂純化總糖之后，經苯酚-硫酸法顯色在紫外分光光度計下測得的總糖水洗部分約占92%左右，醇洗部分約占8%，考慮到糖類物質不溶于乙醇的特性，推測醇洗部分應為苷類物質，所測得的糖為苷類物質在硫酸作用下酸水解的糖或糖鏈，所以用直接稀釋法測得的總糖含量存在一定的偏差，而采用大孔吸附樹脂純化總糖的方法測定復方苦參注射液中的總糖準確可靠。

2.5 樣品純化方法優化

2.5.1 不同型號大孔樹脂考察實驗 分別取預處理后的3種型號大孔樹脂(AB-8、HPD100、D101 )進行濕法裝柱，柱容積為15 mL，精密量取復方苦參注射液(20171102)5 mL，依次進行上樣，每根柱子上樣4次，接其殘留液至molish反應呈陽性后上樣液距大孔樹脂頂端0.5 cm，用水洗脫，接其洗脫液，洗至molish反應呈陰性，然后測各殘留液、水洗液中總糖的含量。由表2可知，AB-8大孔吸附樹脂相比較其他型號樹脂，比吸附量最高，比洗脫量最高，并且洗脫率為100.34%，表明樹脂中未有其他物質被洗脫出，故確定所用大孔吸附樹脂型號AB-8。

2.5.2 大孔吸附樹脂AB-8泄漏曲線考察 取預處理后的大孔吸附樹脂AB-8進行濕法裝柱，柱高為15 cm，精密量取復方苦參注射液(20171102)5 mL，進行上樣，上樣四次，接其流出液每0.5 mL進行分裝，精密量取分裝流出液0.2 mL至20 mL量瓶中，用水稀釋至刻度，搖勻，按2.3項下檢測方法進行吸光度測定，并計算含量。結果表明AB-8大孔吸附樹脂最大上樣量為注射液原液3.5 mL，故暫定為注射液上樣量為 1 mL。如圖1所示。

表2 樣品測定結果

圖1 上樣量與含量關系圖

2.5.3 上樣濃度對吸附效果的影響 精密量取復方苦參注射液(20171102)1 mL，平行量取3份，分別加水稀釋5、3、1倍的樣品濃度進行上樣，吸附 2 h，用水進行洗脫，洗脫流速為 0.566 mL/cm2·min，用量為6BV，收集濾出液至1000 mL量瓶中，用水稀釋至刻度，搖勻，按2.3項下進行檢測，結果表明注射液稀釋5倍時，最接近樣品中含量，故上樣濃度定為稀釋5倍之后上樣。見表3。

表3 上樣濃度考察結果表

2.5.4 吸附時間對吸附效果的影響 精密量取復方苦參注射液(20171102)1 mL，平行量取3份，加水稀釋5倍上樣，分別吸附0、2、4 h，用水洗脫，洗脫流速為0.566 mL/cm2·min，用量為 6 BV，收集濾出液至1000 mL量瓶中，用水稀釋至刻度，搖勻，按2.3項下進行檢測。結果表明各樣品吸附時間RSD為1.34%，無顯著性差異，表明吸附時間對復方苦參注射液總糖分離無影響，故選擇不進行吸附，直接洗脫。見表4。

表4 吸附時間測定結果表

2.5.5 洗脫速度對解吸效果的影響 精密量取復方苦參注射液(20171102)1mL，平行量取3份，加水稀釋5倍上樣，用6BV水洗脫，洗脫流速分別為0.283，0.566，1.132 mL/cm2·min，收集濾出液至1000 mL量瓶中，用水稀釋至刻度，搖勻，按2.3項下進行檢測。結果表明樣品洗脫濃度為0.566 mL/cm2·min時，洗脫樣品含量最高，故洗脫速度定為0.566 mL/cm2·min。見表5。

表5 洗脫速度考察結果表

2.5.6 洗脫濃度對解吸效果的影響 精密量取復方苦參注射液(20171102)1 mL，加水稀釋5倍上樣，分別用水、10%乙醇、20%乙醇、30%乙醇、40%乙醇、50%乙醇、60%乙醇、70%乙醇、80%乙醇、95%乙醇進行洗脫，用量為6BV，洗脫流速為0.566 mL/cm2·min，分別收集流出液至1000 mL量瓶中，用水稀釋至刻度，搖勻，按2.3項下進行檢測，結果表明只有水洗脫流出液中含有糖，故用純水進行洗脫即可。如圖2所示。

圖2 洗脫濃度與含量關系圖

2.5.7 水洗脫體積對解吸效果的影響 精密量取復方苦參注射液(20171102)1 mL，加水稀釋5倍上樣，用水洗脫，洗脫流速為0.566 mL/cm2·min，分別收集洗脫體積為1、2、3、4、5、6、7、8的濾出液至1000 mL量瓶中，用水稀釋至刻度，搖勻，按2.3項下進行檢測。結果表明3BV之后各洗脫體積中總糖含量之間RSD為0.77%，無明顯差異，故洗脫體積定為3BV。如圖3所示。

3 復方苦參注射液總糖含量測定方法學評價

按照確定的條件分別依次進行專屬性、精密度、線性與范圍、重復性、穩定性、耐用性及加標回收率實驗。

3.1 專屬性 分別取空白溶液、樣品溶液及對照品溶液在300～700 nm進行全波長掃描，結果顯示葡萄糖對照溶液與復方苦參注射液樣品溶液最大吸收波長一致，均為487 nm，且空白溶液在最大吸收波長487 nm處無干擾。如圖4所示。

圖3 洗脫體積與含量關系圖

圖4 全波長掃描圖

3.2 精密度 精密量取葡萄糖對照品溶液1.0 mL，按2.3項下方法操作，連續測定6次，RSD為0.06%，儀器精密度良好。

3.3 線性與范圍 精密量取2.1.1項下葡萄糖對照品溶液0.7、1.1、1.5、1.9、2.3 mL，于 25 mL量瓶中，用水稀釋至刻度，得濃度依次為28.06、44.09、60.12、76.15、92.18 μg/mL的對照品標準系列溶液，按2.3項下進行檢測，以吸光度值為縱坐標，濃度為橫坐標作標準曲線，回歸方程為y=0.0102x+0.0473(r=0.9997)，表明無水葡萄糖質量濃度在28.06～92.18 μg/mL范圍內線性關系良好。

3.4 重復性 取同一批號樣品(20181034)6份，分別按2.1.3項下方法制備樣品溶液，再分別取供試品溶液1 mL，按2.3項下方法操作，RSD=1.51%，表明該含量測定方法重復性良好。

3.5 穩定性 樣品溶液顯色后在室溫分別放置0、30、60、90、120、150、180 min后按2.3項下方法操作，在0～180 min內樣品含量結果RSD為0.72%，說明樣品在3 h內穩定。

3.6 耐用性 考察改變測定波長(±2nm)、儀器(型號)條件，計算復方苦參注射液總糖含量RSD，耐用性RSD為0.31%，表明方法耐用性良好。

3.7 回收率 精密量取復方苦參注射液(20181034)4 mL至20 mL量瓶中，精密稱定D-無水葡萄糖(約為1倍樣品中總糖質量)172.37 mg加入上述量瓶中，加水稀釋至刻度，精密量取2.5 mL上樣，用水洗脫，洗脫流速為0.566 mL/cm2·h，用量為3BV，收集濾出液至1000 mL量瓶中，用水稀釋至刻度，搖勻，平行制備6份，按2.3項下方法檢測，結果表明樣品回收率96.84%～104.46%，RSD為2.58%，方法準確性良好。見表6。

加樣回收率(%)=(檢測總量-樣品含量)/加標量×100%。

表6 加標回收率結果

3.8 樣品測定 取復方苦參注射液樣品(20181203、20181204、20181209、20181212、20181213、20181214、20181215、20181138、20181139、20181034)按2.1.3項下樣品制備方法制備，按按2.3項下方法進行檢測，計算復方苦參注射液總糖含量。見表7。

表7 樣品測定結果

表7 樣品測定結果

4 結論

中藥一般含有大量的糖和苷類成分，本產品采用大孔對脂進行純化，將除去苷類等干擾成分，結果可靠。實驗通過比較大孔樹脂AB-8、HPD100、D101三種不同的大孔吸附樹脂的比吸附率與比洗脫率，發現AB-8大孔吸附樹脂對復方苦參注射液的總糖的純化效果最佳，通過對泄露曲線、上樣濃度、吸附時間、洗脫速度、洗脫濃度、洗脫體積綜合考察確定復方苦參注射液總糖的最佳工藝為復方苦參注射液1 mL，稀釋5倍，在床容積(BV)為15 mL的AB-8大孔吸附樹脂柱進行上樣，用3BV水洗脫。

采用經典的苯酚硫酸法測定復方苦參注射液中糖的大類成分，實驗表明糖含量約占總固量的50%左右，主要是單糖和寡糖?！吨兴幾⑸湟喊踩栽僭u價質量控制評價技術原則(試行)》中明確指出，注射劑中所含成分應基本清楚，對注射液總固體中所含成分要進行系統的化學研究，明確總固體中所含大類成分的種類及占總固體的量[9]。實驗對復方苦參注射液中的糖類成分進行了分析測定，有利于復方苦參注射液的質量標準提高和保證臨床用藥安全。