Wnt信號轉導通路在心肌肥厚中作用的研究進展

董建婷，王瓊英，牟玉蘋，陳鑫，余靜

(蘭州大學第二醫院高血壓中心，蘭州 730000)

心肌肥厚是心肌細胞在長期壓力負荷下的一種適應性反應，以維持心臟后負荷持續增加時的心臟收縮功能，其基本細胞形態學改變及病理改變為心肌細胞肥大。然而，病理性心肌肥厚與心室重構有關，心肌肥厚是心血管事件有力的、獨立的心血管事件預測因子，其與高血壓、心房顫動、室性心動過速/心室顫動、心臟性猝死及新發癡呆/認知障礙等疾病的發生率增加有關[1]。目前心肌肥厚的發病機制尚不明確，可能與心肌肥厚相關的細胞信號轉導通路[AMP活化蛋白激酶/哺乳動物雷帕霉素靶蛋白C1/自噬通路、胞外信號調節激酶通路、靶向沉默轉化生長因子-β激活激酶1-p38 促分裂原活化的蛋白激酶/c-Jun氨基端激酶(c-Jun N-terminal kinase，JNK)1/2信號通路、鈣調磷酸酶/活化T細胞因子c3通路等]有關[2-3]。

Wnt信號轉導通路是生物體內一條高度保守的信號通路，能夠調節體內多種生理和病理過程，具有廣泛的生物學意義。Wnt信號轉導通路是目前公認的調控胚胎心臟發育的主要信號通路之一。在胚胎發育早期，Wnt信號轉導通路被激活并促進心臟原基形成；在胚胎發育晚期，該通路下調以維持正常心臟的基本形態與結構；在成人正常心肌細胞中，其表達完全沉默[4]。成人心肌細胞中Wnt信號轉導通路的異常激活可導致心肌肥厚的發生，故該通路可能在心肌肥厚發生發展中發揮重要作用。目前臨床上尚無關于通過Wnt信號轉導通路靶向治療心肌肥厚的報道，現對Wnt信號轉導通路各分子信號組成在心肌肥厚發生中的具體機制及作用予以綜述，探討心肌肥厚治療的可能靶點，以期為心肌肥厚的治療提供思路。

1 Wnt信號轉導通路

1.1組成 Wnt基因在1982年首次發現于小鼠乳腺癌中，曾被稱為Int-1的原癌基因，隨后發現其與果蠅中的Wingless基因同源，故稱為 Wnt基因[5]。目前研究發現，哺乳動物體內的Wnt是由19個Wnt親脂蛋白組成的家族，分子量為39 000～46 000，經過廣泛的翻譯后修飾，以生物活性形式分泌[6]。根據作用將其分為Wnt1類和Wnt5a類。Wnt1類又稱經典Wnt蛋白，包括Wnt1、Wnt2、Wnt3、Wnt3a、Wnt8和Wnt8a，主要參與經典Wnt信號轉導通路，在細胞的形成、分化、增殖、凋亡中起關鍵作用。Wnt5a類又稱非經典Wnt蛋白，包括Wnt4、Wnt5a、Wnt5b、Wnt6、Wnt7a和Wnt11，主要參與非經典Wnt信號轉導通路，在維持細胞內Ca2+水平、細胞極性的建立、細胞骨架重建中發揮重要作用[7]。根據信號的不同，Wnt信號轉導通路分為經典的Wnt/β聯蛋白(β-catenin)信號轉導通路與非經典的Wnt信號轉導通路，后者又包括Wnt/Ca2+信號通路和Wnt/平面細胞極性(the planar cell polarity，PCP)通路。

1.2作用機制 Wnt/β-catenin信號轉導通路通過多種組成成分發揮作用，包括卷曲蛋白(Frizzled，Fzd)、低密度脂蛋白受體相關蛋白(lipoprotein-related receptor protein，LRP)5/6、β-catenin、散亂蛋白(Disheveled，Dvl)、體軸抑制蛋白、糖原合成酶激酶(glycogen synthase kinase，GSK)3β、結腸腺瘤性息肉病蛋白、酪蛋白激酶Ⅰ以及下游蛋白T細胞因子(T-cell factor，Tcf)/淋巴樣增強因子(lymphoid enhancer factor，Lef)等。Wnt/β-catenin信號通路通過以下機制發生作用[5]，無Wnt配體時，體軸抑制蛋白、結腸腺瘤性息肉病蛋白、GSK-3β、酪蛋白激酶1a和β-catenin在細胞質中形成β-catenin降解復合物，磷酸化β-catenin，使其被泛素蛋白酶體靶向降解，細胞核內的轉錄因子Tcf/Lef與Grouch結合，使下游靶基因的激活沉默；當Wnt配體存在時，Wnt信號轉導通路被激活，細胞膜上形成由Wnt配體、Fzd和LRP5/6組成的受體復合物，胞質內的Dvl被招募并與該受體復合物的胞內區結合，Dvl被磷酸化激活后結合β-catenin降解復合物，這一過程抑制了β-catenin的磷酸化，使β-catenin從降解復合物分離，穩定并聚集后進入細胞核，與轉錄因子Tcf/Lef結合，進一步激活Wnt信號傳導通路下游靶基因(如c-myc、c-fos、細胞周期蛋白D1等)的轉錄及表達。

在Wnt/Ca2+信號通路中，Ca2+是最核心的第二信使，由其介導的Fzd信號轉導通路可調節肌肉收縮并激活蛋白激酶C和基因轉錄等過程，對細胞內Ca2+水平的平衡起重要作用。在胚胎生長發育過程中，細胞通過增殖和分化發育為不同的器官和組織，PCP通路被認為是維持該過程穩定性的機制之一，如參與神經管的形成；PCP的信號因子通過Fzd/Dvl復合物發揮作用，誘導細胞骨架重建，并建立細胞極性平衡[8]。

2 經典Wnt/β-catenin信號轉導通路各組成與心肌肥厚

2.1Wnt/β-catenin信號轉導通路上游分子與心肌肥厚 Wnt/β-catenin信號通路的上游分子主要包括膜受體Fzd、LRP5/6及Dvl，此外，Wnt信號轉導通路拮抗分子分泌型Fzd相關蛋白(secreted fizzled related protein，sFRP)也在此水平發揮作用。

Fzd由七個跨膜受體組成，屬于Wnt蛋白的受體，目前已在哺乳動物中發現10種不同的Fzd，不同Fzd激活不同的Wnt通路：部分Fzd與Wnt蛋白結合后可激活Dvl信號，抑制GSK-3β的活性，從而激活經典Wnt通路；而有些Fzd通過介導胞內Ca2+-鈣調蛋白依賴性蛋白激酶 Ⅱ 以及蛋白激酶C激活非經典Wnt通路[9]。Fzd的N端具有獨特的胞外區域，其中由10個高度保守的半胱氨酸殘基形成的5個二硫鍵決定了其三維形狀，這種富含半胱氨酸的結構域被認為是Fzd與Wnt蛋白相互作用的位點[10]。Cerutti等[11]通過不同高血壓/肥厚動物模型[包括自發性高血壓大鼠、里昂高血壓大鼠和雜合子TGR9(mREN2)27大鼠]觀察到Fzd2參與了心肌肥厚的發展，證實Fzd2的表達與大鼠左心室質量指數呈正相關。但目前關于Wnt-Fzd的具體相互作用尚無全面研究，仍需進行大量動物實驗。

Fzd蛋白與Wnt蛋白結合后，還需要結合LRP5和LRP6才能激活Wnt信號通路，LRP5和LRP6均超過1 600個氨基酸，其細胞外結構在信號轉導控制中起重要的調節作用，而其細胞內區域包含多個磷酸化位點，其磷酸化是啟動信號轉導的關鍵步驟[12]。Alapati等[13]在高氧誘導的新生兒肺損傷小鼠模型中證實，LRP5/6與肺動脈高壓及心室肥大呈正相關；缺氧性新生兒通常會發生肺損傷，引起肺動脈高血壓，可能進一步導致右心室肥大，上述改變均與Wnt/β-catenin信號轉導通路的激活有關；當通過Wnt-LRP5/6復合阻滯劑——Mesd抑制Wnt信號轉導后，肺動脈高壓和右心室肥大較前減輕，證實了阻斷LRP5/6可產生抗心室心肌肥厚的作用。

Dvl蛋白是細胞內受體水平Wnt信號轉導的重要組成部分，是形成Wnt/Fzd支架復合物的重要中介。目前已發現3個脊椎動物Dvl功能結構域，①Dvl的N端DIX結構域，參與了體軸抑制蛋白與Fzd及LRP5/6的結合，與Wnt/β-catenin信號轉導通路有關；②Dvl中間部分的PDZ(Postsynaptic density/Discs large/Zonula occludens)結構域，可與Fzd結合；③Dvl的C端DEP結構域可與PDZ結構域共同參與PCP通路及G蛋白偶聯信號通路，與非經典的Wnt信號通路相關[14]。van de Schans等[15]對主動脈帶扎術的小鼠模型的研究顯示，術后7 d，Dvl1 WT小鼠心肌后壁厚度增加，心肌肥大標志物(心房尿鈉肽)和(腦鈉肽)的表達水平增加1倍以上，且β-catenin表達上調，經典Wnt通路激活，但術后4周Dvl1 KO小鼠才發生上述變化，表明Dvl1的表達與心肌肥厚有關，Dvl1基因缺失可延遲心肌肥大的發生。Hagenmueller等[16]的研究證實，Dapper-1是Dvl2介導心肌肥大和左心室重構的關鍵調節因子，過表達Dapper1小鼠心肌細胞橫截面積增大，并可誘導肥大標志物心房尿鈉肽、腦鈉肽和β肌球蛋白重鏈表達，同時小鼠體內出現Dvl2高表達，證實Dvl蛋白與心肌肥厚存在正相關關系。

目前關于Wnt/Fzd通路的研究主要集中于其拮抗分子——sFRP。sFRP的N端與Fzd富含半胱氨酸的結構域序列具有30%～50%的相似性，類似于Fzd，但因缺乏穿膜區而不能和質膜結合，其主要作用機制是通過清除細胞外Wnt抑制Wnt信號，阻止Wnt與Fzd結合，從而對該通路進行負向調控[17]。然而，在哺乳動物心臟重構和修復中sFRP的作用高度復雜，可能是Wnt通路的激活劑通過形成同質或異質sFRP復合物增加細胞內β-catenin的積累，以利于Wnt信號轉導[18]。一項關于野生型小鼠和sFRP-1缺乏小鼠的實驗發現，隨著實驗的進行，sFRP-1基因缺失小鼠的死亡率與野生型小鼠比較差異無統計學意義；但隨小鼠月齡的增加，sFRP-1基因缺失小鼠逐漸出現心臟結構異常和功能障礙，除心功能惡化和大量心肌纖維化外，還觀察到擴張型心肌病的所有特點；sFRP-1缺失導致老年心臟中Wnt配體(Wnt 1、3、7b和16)、Wnt靶基因Wnt1誘導信號通路蛋白1和Lef1的表達增加，與β-catenin蛋白水平升高有關，提示sFRP-1基因表達下降，可能增加Wnt1誘導信號通路蛋白1及β-catenin在缺血性擴張型心肌病中的表達[19]。

2.2細胞質內β-catenin聚集與心肌肥厚 Wnt/β-catenin信號通路作用機制部分提到，在Wnt信號產生的情況下，細胞質內β-catenin磷酸化被抑制，β-catenin降解復合物分離，使β-catenin在細胞質中穩定并聚集。目前較多研究集中于β-catenin和GSK-3β。

β-catenin是一組分子量在80 000左右的蛋白質，也是Wnt/β-catenin信號通路的核心分子。β-catenin在細胞中有兩種不同功能[20]：①β-catenin是鈣黏蛋白-聯蛋白細胞黏附復合物的一部分；②β-catenin是基因轉錄的重要調節因子。目前Wnt通路的大量基礎實驗都集中于β-catenin。β-catenin有多個磷酸化位點，其功能狀態由其磷酸化和穩定狀態決定。β-catenin信號在體外和體內均可誘導心肌細胞肥大的發生。Lee等[21]的研究證實，急性心肌梗死患者體外心肌細胞以及自發性高血壓大鼠心臟組織中均存在β-catenin表達和核易位升高；且β-catenin過表達通過激活胞外信號調節激酶1/2、JNK和p38使心肌細胞發生肥厚性反應。β-catenin在不同心肌肥大實驗中的作用不同，Khan等[22]對使用GSK-3β抑制劑CHIR99021缺血再灌注損傷心肌細胞模型的實驗發現，河馬信號通路的主要信號Yes相關蛋白1與β-catenin在抑制缺血再灌注損傷后細胞肥大的過程中具有協同作用。然而，Baurand等[23]的研究顯示，血管緊張素(angiotensin，Ang)Ⅱ灌注2周的β-catenin特異性缺乏小鼠的心肌細胞出現肥大反應，而β-catenin穩定表達小鼠的心肌細胞較基線時的橫截面積減小，且未出現AngⅡ所致的肥大反應。上述研究結果的差異可能與不同模型導致心肌細胞的不同反應有關，穩定的β-catenin足以誘導心肌細胞肥大，但其確切作用仍需深入研究。

GSK-3β是一種普遍存在的絲氨酸/蘇氨酸激酶，在多種細胞功能中起至關重要的作用，如代謝、基因表達及細胞骨架完整性的維持，主要包括GSK-3α和GSK-3β兩個亞型[24]。GSK-3β能夠廣泛磷酸化底物并抑制其活性，決定性地介導β-catenin依賴和獨立的級聯反應。在一項試驗中，阿司匹林有效逆轉了主動脈縮窄小鼠模型和AngⅡ誘導的血管平滑肌肥大模型中的β-catenin上調以及GSK-3β下調，并可抑制心肌肥大的發生，證實GSK-3β在Wnt通路中具有負向調控作用[25]。Zhang等[26]的研究發現，抑制GSK-3β信號有利于保護心肌細胞，但對心肌肥厚不利；在GSK-3β基因敲除小鼠左心室功能明顯提高，而未敲除GSK-3β基因小鼠未存活。

2.3Wnt/β-catenin信號轉導通路下游分子與心肌肥厚 β-catenin不含DNA結合結構域，因此為了調控基因的表達，穩定并聚集到細胞核中的β-catenin需要與轉錄因子形成復合物。在細胞核中，β-catenin與Tcf/Lef結合激活Wnt信號靶基轉錄。Tcf/Lef蛋白屬于核蛋白高遷移率族蛋白超家族，是Wnt信號通路的主要下游效應因子[27]。目前研究發現，哺乳動物Tcf/Lef家族包括Tcf7、Lef1、Tcf7L1和Tcf7L2四個核因，也稱為Tcf1、Lef1、Tcf3、Tcf4，其中結合Tcf1和Tcf4的β-catenin復合物可以作為下游靶基因的激活劑[28]。Tcf/Lef蛋白與心肌肥厚呈正相關，在AngⅡ誘導的新生大鼠心肌細胞肥大模型中，AngⅡ通過超氧化物歧化酶蛋白激酶B/GSK-3β/β-catenin/Tcf/Lef途徑激活誘導Wnt1誘導信號通路蛋白1的表達，Tcf/Lef蛋白的表達增加，而AT1拮抗劑氯沙坦預處理以及敲除Wnt1誘導信號通路蛋白1均可顯著抑制該效應[29]。

c-myc是Wnt通路的下游靶基因，屬于原癌基因，是調控細胞周期和增殖的主要基因。c-myc與心肌肥厚呈正相關，在1型糖尿病小鼠造模成功4周后，糖尿病組小鼠心肌細胞中β-catenin、心房鈉尿肽前體A基因及c-myc表達上調，心肌肥厚發生；而使用β-catenin核轉錄抑制劑(ICRT 14)小鼠心肌細胞中β-catenin、心房鈉尿肽前體A基因及c-myc的表達下調[30]。

幾乎所有Wnt信號分支都參與了心肌肥厚的調節。成年雄性C57BL/6J小鼠接受主動脈縮窄術或假手術，在主動脈縮窄手術后4周內每天腹腔注射Wnt信號通路阻滯劑——重樓皂苷Ⅰ，通過超聲心動圖和組織學分析發現，重樓皂苷Ⅰ減弱了主動脈縮窄引起的心臟肥大，表現為心臟質量降低、心肌細胞橫截面積縮小、心臟纖維化減弱以及肥大生物標志物(心房鈉尿肽、腦鈉肽和β-MHC)降低，且β-catenin/總β-catenin、GSK-3β、c-myc、c-jun、c-fos表達水平降低；此外，重樓皂苷Ⅰ還可改善AngⅡ誘導的體外心肌細胞肥大[31]。

3 非經典Wnt信號轉導通路與心肌肥厚

有些Wnt蛋白(包括Wnt1、Wnt5a和Wnt11等)不依賴經典Wnt/β-catenin通路，不產生內源性β-catenin累積信號，而是需要非經典Wnt信號轉導通路(如Wnt/Ca2+信號通路和Wnt/PCP信號通路)的參與。非經典通路的激活同樣需要激活胞質內Dvl，以募集下游蛋白。

Wnt/Ca2+信號通路主要通過激活Ca2+相關的酶[鈣調蛋白依賴激酶Ⅱ(calcium/calmodulin-dependent protein kinase Ⅱ，CaMKⅡ)、鈣調磷酸酶及鈣調素等]發揮作用[32]。CaV1.2通道、CaMKⅡ和鈣調素調節細胞內Ca2+水平，細胞內Ca2+水平與心肌肥大有關。體內實驗顯示，異丙腎上腺素刺激可引起SD大鼠心臟及心肌細胞肥大，且CaV 1.2通道在體內和體外模型中的表達無差異，但異丙腎上腺素刺激誘導的CaV 1.2通道活性增加，Ca2+水平升高；異丙腎上腺素組CaMKⅡ和磷酸化CaMKⅡ的表達水平均升高，鈣調素表達水平下降，表明心肌肥厚時，細胞內Ca2+水平增加，CaMKⅡ與CaV1.2的結合能力增強，與鈣調素相比，CaMKⅡ可能是更重要的逆轉心肌肥厚的藥物靶點[33]。

在Wnt/PCP途徑中，Wnt蛋白與細胞表面的Fzd結合后通過活性氧類/JNK/轉錄因子ⅡB相關因子1途徑激活JNK等的表達，從而輔助細胞骨架組織和基因表達的調控。去氧腎上腺素誘導建立SD大鼠乳鼠心肌細胞肥大模型，去氧腎上腺素劑量依賴地引起心肌細胞內活性氧類的生成增多、JNK活化以及轉錄因子ⅡB相關因子1表達增多；而JNK抑制劑可抑制JNK的激活，進而抑制心肌細胞肥大[34]；在此研究中，新型鈣通道阻滯劑碘化N-正丁基氟哌啶醇可抑制肥大心肌細胞中活性氧類的生成，并抑制JNK的活化，從而拮抗心肌肥厚的發生，因此Wnt/Ca2+信號通路與Wnt/PCP信號通路可能共同參與調節心肌肥厚的發生，但仍需進一步研究的證實。

目前對于非經典Wnt信號轉導通路在心肌肥厚發生機制中作用的研究有限，尚不明確其具體調節過程及相互作用，且非經典Wnt信號轉導通路與經典Wnt信號轉導通路之間的相互作用亦不清楚，需要更多研究的證實。

4 小 結

Wnt信號轉導通路與多種生理功能和疾病相關，大量配體、受體參與該通路，可在不同分子水平上對生物體進行調控。目前有關Wnt信號通路中相關分子組成的研究結果尚不一致，如激活GSK-3β可能抑制心肌肥厚或促進心肌細胞凋亡，導致上述結果的原因可能與實驗動物模型、干預藥物以及其他變量之間的差異有關。此外，幾乎所有Wnt/β-catenin信號轉導通路的成分都至少在一個非編碼RNA調控下表達，其中一些非編碼RNA在心肌肥厚中的意義已經被報道[35]。因此，需要更多研究來揭示Wnt信號轉導通路中各分子信號參與心肌肥厚的復雜機制及相互調控，以為心肌肥厚的靶向治療提供新的思路及實驗依據。