ER-α36介導(dǎo)乳腺癌中曲妥珠單抗耐藥的新機制

駱藝，黃劍

(1.廣東醫(yī)科大學(xué)，廣東 湛江 524023；2.廣東醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院病理診斷與研究中心，廣東 湛江 524000)

乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤之一，存在高度異質(zhì)性，而腫瘤異質(zhì)性是導(dǎo)致腫瘤耐藥和治療失敗的內(nèi)在因素。近年來，乳腺癌發(fā)病率逐年升高并呈年輕化趨勢。據(jù)國際癌癥研究機構(gòu)統(tǒng)計，乳腺癌已超越肺癌成為世界上最常見的癌癥[1-2]。根據(jù)組織學(xué)特征，其可分為激素受體陽性乳腺癌、人表皮生長因子受體2(human epidermal growth factor receptor 2，HER2)陽性乳腺癌和三陰性乳腺癌。HER2陽性乳腺癌占全部乳腺癌的15%～20%，復(fù)發(fā)率和轉(zhuǎn)移率較高，患者的生存時間短、預(yù)后較差[3-6]。乳腺癌的治療主要包括內(nèi)分泌治療、抗HER2靶向治療和化療。其中，曲妥珠單抗是靶向治療HER2陽性乳腺癌的一線藥物，效果較好[7]。但曲妥珠單抗抗HER2治療最終會發(fā)生耐藥[8-9]。在曲妥珠單抗耐藥的患者中，30%～40%的患者雌激素受體(estrogen receptor，ER)水平較高，ER與HER2相互作用會促進乳腺癌細胞增殖，并引起內(nèi)分泌治療耐藥[6,10-11]。ER-α36是ER-α66的剪切變異體，其與HER2及其相關(guān)信號分子可能發(fā)生物理性相互作用，導(dǎo)致HER2信號通路的活化和耐藥。現(xiàn)就ER-α36的結(jié)構(gòu)、功能及引起曲妥珠單抗耐藥的可能機制予以綜述，以為今后臨床克服曲妥珠單抗耐藥提供新思路。

1 ER-α36與曲妥珠單抗

1.1ER-α36

1.1.1ER-α36的結(jié)構(gòu) ER-α36由Wang等[12]發(fā)現(xiàn)，分子量為36 000。ER-α36缺乏轉(zhuǎn)錄激活域，但保留了DNA結(jié)合域以及部分ER-α66的二聚體和配體結(jié)合區(qū)域。ER-α36主要在質(zhì)膜和細胞質(zhì)表達，其C端具有的獨特的27個氨基酸序列可替代ER-α66基因外顯子7和8編碼的C端的138個氨基酸，ER-α36還具有3個潛在的酰基化位點[13-14]。ER-α36從ER-α66基因的第1個內(nèi)含子中的啟動子開始編碼，轉(zhuǎn)錄后可形成特異性ER-α36蛋白，該蛋白參與ER的多條信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。

1.1.2ER-α36的功能 ER-α36為膜型ER，在ER-α66陰性和陽性乳腺癌細胞中均有表達，尤其是在缺乏ER-α66、ER-α46和ER-β的ER陰性乳腺癌細胞中高表達[15]。乳腺癌細胞的轉(zhuǎn)移以及對他莫昔芬的耐藥均與ER-α36的表達相關(guān)，應(yīng)用他莫昔芬治療ER-α66陽性且ER-α36高表達的乳腺癌無效[16]。研究發(fā)現(xiàn)，ER-α36在具有高侵襲性、高復(fù)發(fā)風險和預(yù)后更差的三陰性乳腺癌中也高表達[15,17]。表明ER-α36可促進乳腺癌細胞的增殖，并與乳腺癌的發(fā)展及預(yù)后密切相關(guān)。

1.2曲妥珠單抗 曲妥珠單抗是首個獲得美國食品藥品管理局批準的治療HER2陽性乳腺癌的藥物，是一種針對HER2胞外結(jié)構(gòu)域的重組DNA衍生的人源化單克隆抗體，可通過與癌細胞膜上的HER2結(jié)合，阻止HER2二聚化，阻斷下游信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，抑制癌細胞增殖；還可觸發(fā)宿主免疫系統(tǒng)攻擊和殺死曲妥珠單抗結(jié)合的腫瘤細胞，這種免疫反應(yīng)稱為抗體依賴性細胞介導(dǎo)的細胞毒作用，始于自然殺傷細胞上的FCγ受體與曲妥珠單抗的Fc部分結(jié)合[18-19]。HER2陽性乳腺癌患者的預(yù)后不良、死亡率較高，并可在短時間復(fù)發(fā)且轉(zhuǎn)移率高。臨床研究表明，抗HER2的重組單克隆抗體曲妥珠單抗能顯著延長HER2陽性乳腺癌患者的無病生存期和無進展生存期；除紫杉醇和多西他賽外，曲妥珠單抗是HER2陽性轉(zhuǎn)移性乳腺癌的標準一線治療藥物[5,9,20]。曲妥珠單抗用于轉(zhuǎn)移性和早期乳腺癌的治療，從根本上改善了HER2陽性乳腺癌的預(yù)后[21]。而應(yīng)用曲妥珠單抗后，約70%的患者會出現(xiàn)原發(fā)性或獲得性耐藥，但耐藥機制尚未完全闡明，可能的耐藥機制包括HER家族成員間形成二聚體，磷脂酰肌醇-3-激酶(phosphatidylinositol-3-kinase，PI3K)-蛋白激酶B(protein kinase B，PKB/Akt)信號通路過度激活，人第10號染色體缺失的磷酸酶及張力蛋白同源基因的突變或丟失，其他受體酪氨酸激酶(如胰島素樣生長因子1受體和肝細胞生長因子受體c)活性的上調(diào)[22]。

在15%～20%的HER2陽性乳腺癌中，有50%～60%也表達ER；在HER2和ER均陽性的乳腺癌中，隨著腫瘤細胞ER表達的增加，曲妥珠單抗的療效逐漸降低，提示曲妥珠單抗耐藥可能與HER2和ER之間的相互作用以及激活新的信號通路有關(guān)[23-24]，但具體機制尚不明確。ER-α36是近年新發(fā)現(xiàn)的膜型ER，下調(diào)ER-α36的表達可降低三陰性人乳腺癌MDA-MB-231細胞的遷移和侵襲能力[25]。研究發(fā)現(xiàn)，ER-α36與表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor，EGFR)/HER2存在正向調(diào)節(jié)作用[26-29]，提示ER-α36過表達可激活HER2及下游信號通路，這可能是曲妥珠單抗耐藥的新機制。綜上可知，針對ER-α36的靶向治療可能為克服曲妥珠單抗耐藥提供新思路。

2 ER-α36參與HER2陽性乳腺癌曲妥珠單抗耐藥的機制

2.1ER-α36通過快速雌激素信號通路參與HER2耐藥 HER2是受體酪氨酸激酶HER(也稱為ErbB)家族成員。ErbB家族包括4個成員：ErbB1(EGFR、HER1)、ErbB2(HER2)、ErbB3(HER3)和ErbB4(HER4)。ErbB作為非活性單體在細胞膜表面表達，在配體存在的情況下，受體酪氨酸激酶發(fā)生同源或異源二聚體化，導(dǎo)致構(gòu)象改變，促進細胞內(nèi)HER家族的自磷酸化[30]。配體誘導(dǎo)的構(gòu)象改變可引起C端酪氨酸殘基的自磷酸化，使Src結(jié)構(gòu)域介導(dǎo)蛋白質(zhì)之間相互作用，從而使信號通過PI3K-Akt通路轉(zhuǎn)導(dǎo)。HER2缺乏細胞外配體，除形成同源二聚體外，還可與ErbB家族的其他成員以及其他受體酪氨酸激酶形成異源二聚體[6,30]。激活的HER2同源和異源二聚體調(diào)控著一個復(fù)雜的下游信號網(wǎng)絡(luò)，該網(wǎng)絡(luò)調(diào)節(jié)細胞的存活和轉(zhuǎn)移。HER2主要與HER3形成異源二聚體，該二聚體被認為是HER2介導(dǎo)致癌功能的主要信號實體，可誘導(dǎo)下游不同的促生存和致瘤途徑，包括PI3K-Akt和促分裂原活化的蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)信號通路[31]。

曲妥珠單抗的耐藥機制包括已存在或新出現(xiàn)的替代信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，這些信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑提供補償信號以抵消和克服HER2靶向治療的抑制作用，其中最主要的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑為ER信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。ER通過提供可替代的增殖和存活信號，重新表達、激活HER2阻斷的通路，從而起到代償性逃避途徑的作用[32-33]。然而經(jīng)典ER蛋白主要定位于細胞核，HER2主要定位于細胞膜，因此理論上它們之間存在物理性相互作用的可能性較小，由此可推測與HER2發(fā)生作用的是定位于細胞質(zhì)和質(zhì)膜的ER蛋白剪切變異體ER-α36蛋白。與傳統(tǒng)的ER-α和ER-β不同，ER-α36主要在細胞膜和細胞質(zhì)中表達，雖然缺乏內(nèi)在轉(zhuǎn)錄能力，但可介導(dǎo)與胰島素樣生長因子1受體、EGFR和HER2等相關(guān)的快速雌激素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。快速雌激素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路即非基因組信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，也稱為核外或膜啟動信號通路，由多種生長因子及其相應(yīng)受體共同參與[25-26]，包括腺苷酸環(huán)化酶通路、蛋白激酶C通路、G蛋白偶聯(lián)受體激活通路、PI3K-Akt和MAPK信號通路、Ca2+通路和Src激酶激活的信號通路等[34-35]。這些快速反應(yīng)通路的相互作用可提高細胞內(nèi)Ca2+水平，調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄，誘導(dǎo)細胞周期失調(diào)，然后通過調(diào)節(jié)不同的下游信號通路導(dǎo)致細胞異常增殖和分化，其與抗雌激素藥物的耐藥密切相關(guān)[12,31,36]。PI3K-Akt信號通路在多種腫瘤的發(fā)展過程中起調(diào)控作用，其通過突變獲得或喪失某些功能而解除調(diào)控，激活乳腺癌中的致癌通路，并與細胞轉(zhuǎn)化和腫瘤發(fā)生相關(guān)[37]。已知PI3K-Akt信號通路的結(jié)構(gòu)性激活與HER2耐藥有關(guān)，且目前普遍認為PI3K-Akt及MAPK-胞外信號調(diào)節(jié)激酶信號通路的過度激活是曲妥珠單抗耐藥的主要機制之一[33]，提示ER-α36介導(dǎo)的快速雌激素信號通路與曲妥珠單抗的耐藥存在關(guān)聯(lián)。

2.2ER-α36通過與EGFR/HER2形成正向調(diào)控介導(dǎo)曲妥珠單抗耐藥 在乳腺癌中，膜相關(guān)的ER-α36的激活伴隨EGFR的反式激活，EGFR的反式激活誘導(dǎo)快速激酶級聯(lián)反應(yīng)，從而影響細胞的增殖和存活[38]。ER-α36與EGFR共表達，形成一個正調(diào)控環(huán)，可激活ER-α36基因啟動子上的轉(zhuǎn)錄因子激活蛋白1，導(dǎo)致ER-α36基因轉(zhuǎn)錄，調(diào)節(jié)ER-α36與EGFR在腫瘤細胞中的表達，從而促進腫瘤細胞的惡性生長；ER-α36亦可通過與EGFR/原癌基因酪氨酸蛋白激酶SRC/銜接蛋白Shc復(fù)合物相互作用，加強EGFR信號通路的作用，還可通過銜接蛋白Shc/EGFR/信號轉(zhuǎn)導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活因子5途徑介導(dǎo)雌激素誘導(dǎo)的細胞周期蛋白D1啟動子的激活，從而導(dǎo)致三陰性乳腺癌細胞增殖增加[28,34,39-40]。采用小干擾RNA敲除ER-α36后，乳腺癌細胞中的HER2和EGFR表達均減少；采用EGFR酪氨酸激酶抑制劑AG1478(4-(3-氯苯胺基)-6，7-二甲氧哇哇琳)、EGFR和HER2雙酪氨酸激酶抑制劑拉帕替尼或MAPK/胞外信號調(diào)節(jié)激酶抑制劑U0126(1,4-二氨基-2,3-二氰基-1,4-雙(2-氨基苯硫基)丁二烯)均可有效下調(diào)乳腺癌細胞中ER-α36的表達；敲低乳腺癌細胞中ER-α36的表達，亦可減少HER2和EGFR的表達，同時減少EGFR/原癌基因酪氨酸蛋白激酶SRC/銜接蛋白Shc復(fù)合物，阻滯PI3K/Akt及MAPK/胞外信號調(diào)節(jié)激酶信號通路，并恢復(fù)HER2陽性乳腺癌細胞對曲妥珠單抗的敏感性[27,41]。綜上可知，ER-α36與EGFR/HER2之間存在陽性調(diào)控循環(huán)，其可激活PI3K/Akt及MAPK/胞外信號調(diào)節(jié)激酶信號通路，調(diào)節(jié)腫瘤細胞的惡性生長，并介導(dǎo)曲妥珠單抗耐藥。

2.3ER-α36通過影響乳腺癌干細胞(breast cancer stem cells，BCSCs)調(diào)控曲妥珠單抗敏感性 1994年，腫瘤干細胞(cancer stem cells，CSCs)首先在急性髓系白血病中被發(fā)現(xiàn)，其是腫瘤細胞的一個子集，通常占腫瘤細胞的1%～5%(在乳腺癌中可高達11%～35%)，是一種具有遺傳或獲得性干細胞樣特征的癌細胞，盡管出現(xiàn)頻率不高，但參與腫瘤發(fā)展的所有階段，包括原發(fā)腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)[42]。CSCs可通過增加外排轉(zhuǎn)運蛋白和抗凋亡蛋白的表達或抵抗電離輻射而產(chǎn)生耐藥性，是治療后復(fù)發(fā)和增加不良預(yù)后風險的潛在因素[43]。CSCs模型表明，具有相似遺傳背景的腫瘤細胞可根據(jù)其致瘤潛力進行分層，而CSCs位于層級結(jié)構(gòu)的頂端，在大部分腫瘤中CSCs擁有腫瘤啟動和轉(zhuǎn)移能力[44]。

與野生型乳腺癌細胞MCF-7相比，CD44在MCF-7腫瘤干細胞子集中的表達上調(diào)，并與其主要配體透明質(zhì)酸結(jié)合，激活多種信號通路，引起細胞增殖、黏附、遷移和侵襲[45]。聚集的腫瘤細胞豐富表達BCSCs標志物CD44，促進腫瘤的形成和多克隆轉(zhuǎn)移；而CD44的缺失有效阻止了腫瘤細胞的聚集，降低p21蛋白-激活激酶2水平[46]。以上研究提示，乳腺癌可能起源于具有自我更新能力的BCSCs，其特征為CD44high/CD24low表型和乙醛脫氫酶(aldehyde dehydrogenase，ALDH)1活性與其他CSCs類似，BCSCs具有自我更新和分化、保持休眠/靜止以及逃避免疫系統(tǒng)清除的能力[47]。ALDH亞型、CD44和CD29表達的上調(diào)提示BCSCs的富集性。BCSCs以兩種狀態(tài)存在，即上皮樣細胞(如具有高ALDH活性的細胞)和間充質(zhì)樣細胞，其特征為CD24低表達、CD44高表達，上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化和可逆性間充質(zhì)-上皮轉(zhuǎn)變揭示了BCSCs的轉(zhuǎn)移潛能。CD24-、CD44+的間充質(zhì)樣BCSCs主要處于靜止狀態(tài)，定位于腫瘤表面；而上皮樣BCSCs表達ALDH，增殖旺盛，位于腫瘤中心。與其他腫瘤干細胞不同，BCSCs的可塑性使其能夠進行上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化，也可進行可逆的間充質(zhì)-上皮轉(zhuǎn)化，使乳腺癌細胞在轉(zhuǎn)移部位具有侵襲、擴散和生長的能力[48]。目前認為，ALDH是人類BCSCs的標志物。ALDH與ER陽性乳腺癌的耐藥相關(guān)[49]，且ALDH的高水平和活性與乳腺癌患者治療后不良臨床結(jié)局直接相關(guān)，而ER-α36的表達與ALDH1呈正相關(guān)，ER-α36的減少可降低ALDH1高活性細胞的生長速度和比例，表明ER-α36有助于干細胞樣細胞的維持和增殖[47,49]。在ER陽性乳腺癌細胞中，通過使用短發(fā)夾RNA敲低ER-α36的表達，可減少ER陽性BCSCs中快速雌激素信號的轉(zhuǎn)導(dǎo)，并顯著降低BCSCs的百分比，表明ER-α36可通過快速雌激素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路對BCSCs的增殖產(chǎn)生影響[35]。曲妥珠單抗的獲得性耐藥與腫瘤干細胞數(shù)量的增加相關(guān)[50]，可通過靶向ER-α36抑制BCSCs生長，從而影響曲妥珠單抗的敏感性。靶向ER-α36在預(yù)防HER2陽性乳腺癌轉(zhuǎn)移、降低耐藥和復(fù)發(fā)風險方面前景廣泛，深入了解ER-α36蛋白及BCSCs生物學(xué)和關(guān)鍵信號通路，對明確HER2陽性乳腺癌對曲妥珠單抗靶向治療耐藥的機制至關(guān)重要。

3 小 結(jié)

為改善腫瘤患者的預(yù)后需要對腫瘤的潛在發(fā)病機制進行更深入的研究。經(jīng)過學(xué)者們多年的不懈努力，乳腺癌的研究取得了一系列有價值的進展。ER-α36作為膜型ER，介導(dǎo)快速雌激素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，可與HER2相互作用，促進BCSCs增殖，進而促進乳腺癌的發(fā)生、發(fā)展和耐藥。長期以來，對HER2陽性乳腺癌患者的靶向治療目標是延長患者無病生存期和無進展生存期、改善預(yù)后，然而其主要靶向治療藥物曲妥珠單抗耐藥已成為臨床面臨的巨大問題。未來，進一步闡明ER-α36的作用和參與的主要信號通路及過程，可為HER2陽性乳腺癌產(chǎn)生曲妥珠單抗耐藥的潛在機制提供新見解，為HER2陽性乳腺癌的治療提供新方向和靶點。