m6A RNA甲基化修飾在泌尿系統腫瘤中的研究進展

江志成，簡文剛，于政一，張誠

(哈爾濱醫科大學附屬第一醫院泌尿外科，哈爾濱 150001)

轉錄后修飾是許多生理過程和疾病進展中十分重要的調控因素，并已成為生命科學研究的熱點。目前經鑒定，在生物體中有超過100種不同類型的轉錄后RNA化學修飾[1]。在真核生物中，信使RNA(messenger RNA，mRNA)出現了3種類型的RNA修飾：N6-甲基腺苷(N6-methyl-adenosine，m6A)、5-甲基胞嘧啶和N1-甲基腺苷，其中m6A是最常見和最豐富的修飾之一。m6A的修飾調控需要3種類型分子：甲基轉移酶、去甲基化酶和甲基化識別蛋白。m6A RNA甲基化修飾幾乎參與了RNA調控的各個階段，影響RNA成熟、轉錄、定位、翻譯和代謝，從而發揮重要的生物學功能，包括神經系統發育、晝夜節律調控、DNA損傷反應、熱激反應和腫瘤發生等[2-3]。近年來，隨著泌尿系統腫瘤發病率和死亡率的不斷上升，現有治療手段有限，因此需深入了解其發病的內在分子機制及信號通路并確定生物標志物，以早期診斷、預測預后并提供包括個性化靶向治療在內的治療指南。m6A調節因子與泌尿系統腫瘤相關信號通路的激活和抑制密切相關。通過檢測腫瘤中m6A甲基化水平，確定m6A調控分子和靶基因RNA修飾的關系，有助于認識腫瘤發生發展機制，為患者個體化治療提供新的治療策略。現就m6A RNA甲基化修飾在泌尿系統腫瘤中的研究進展予以綜述。

1 m6A RNA甲基化修飾

m6A RNA甲基化修飾是以S-腺苷甲硫氨酸為甲基供體，通過細胞內甲基轉移酶催化，在底物腺嘌呤第6位氮原子上發生的一種甲基化修飾[4]，其最早于20世紀70年代發現，廣泛存在于真核生物mRNA、轉運RNA、核糖體RNA和非編碼RNA中。RNA甲基化(m6A)免疫共沉淀高通量測序技術聯合高通量測序用于檢測RNA m6A甲基化位點，打破了人們對m6A RNA甲基化修飾認知的局限性。但RNA甲基化(m6A)免疫共沉淀高通量測序技術靶向的RNA片段被限制于100 nt左右，導致無法準確檢測單核苷酸改變的甲基化位點等，而光交聯輔助m6A測序技術[5]、m6A單堿基分辨率紫外交聯沉淀技術[6]的出現，使得RNA m6A甲基化位點的檢測更加精準。

參與m6A RNA甲基化修飾的3種酶(甲基轉移酶、去甲基化酶、和甲基化識別蛋白)之間相互交聯，參與了癌癥的發生和進展。其中，多種甲基轉移酶構成甲基轉移酶復合物(methyltransferase complex，MTC)，催化底物發生m6A RNA甲基化修飾。MTC由甲基轉移酶樣蛋白(methyltransferase-like protein，METTL)3催化亞基和其他輔助亞基[METTL14、腎母細胞瘤1關聯蛋白(wilms tumor 1 associated protein，WTAP)、Vir樣m6A甲基轉移酶相關蛋白(Vir-like m6A methyltransferase associated protein，VIRMA/KIAA1429)、RNA結合基序蛋白15和ZC3H13(zinc finger CCCH-type containing 13)等]組成[7]。METTL3與METTL14以1∶1的比例形成穩定的復合物，識別底物RRACH(R=A或G，H=A，C或U)序列，誘導m6A修飾RNA[8]。METTL3-METTL14形成的異源二聚體通過WTAP定位于核散斑體，且WTAP招募其他蛋白加入MTC，從而影響m6A RNA甲基化修飾的整體水平，而RNA結合基序蛋白15/15B通過協助METTL3和WTAP結合，將結合的復合物招募到特定的RNA位點發揮作用[9]。ZC3H13通過橋接WTAP和mRNA結合因子Nito來增強m6A RNA甲基化修飾[10]。VIRMA/KIAA1429招募MTC到RNA終止密碼子和3′非翻譯區附近發生m6A RNA甲基化修飾[11]。此外，METTL16是新發現的甲基轉移酶，其催化U6-核小RNA發生m6A甲基化修飾并參與前體RNA的剪接，且METTL16結合位點與METTL3-METTL14甲基化復合物的結合位點沒有重疊[12]。因此，m6A甲基轉移酶復合物可能還有其他成分。

去甲基化酶的作用是去除RNA發生的m6A甲基化修飾。截至目前，已鑒定出兩種哺乳動物m6A去甲基化酶，即脂肪和肥胖相關蛋白(fat mass and obesity associated protein，FTO)和Alk B同源蛋白5(Alk B homologue 5，ALKBH5)，這兩種蛋白主要定位于m6A RNA甲基化修飾被去除的細胞核中。FTO是第一個發現的m6A去甲基化酶，其具有高度保守的催化結構域，最初被發現與人類體重增加和肥胖有關。第二鑒定出的m6A去甲基化酶ALKBH5能夠特異性識別m6A標記發生去甲基化。近年學者發現，ALKBH3可能是一種新型的m6A修飾去甲基化酶[13]。他們發現哺乳動物轉運RNA的m6A甲基化修飾是ALKBH3的底物，ALKBH3優先作用于轉運RNA而不是mRNA或核糖體RNA。

與甲基轉移酶和去甲基化酶不同，甲基化識別蛋白的作用是識別RNA發生m6A甲基化修飾甲基化識別蛋白，結合RNA并實現相應的功能，包括YTH(YT521-B homology)家族、胰島素樣生長因子2 mRNA結合蛋白(insulin-like growth factor 2 mRNA-binding proteins，IGF2BPs)、真核翻譯起始因子3、核內不均一核糖核蛋白(heterogeneous nuclear ribonucleoproteins，HNRNP)家族。在YTH家族中，YTH結構域是識別m6A的模塊，包括YTHDF1～3、YTHDC1～2。雖然YTH家族有十分相似的結構域，但不同的甲基化識別蛋白在m6A RNA甲基化修飾中發揮不同的作用。其中，YTHDF1能選擇性地與終止密碼子附近的m6A位點結合，并與起始因子相互作用，增強mRNA的翻譯和蛋白合成[14]。YTHDF2通過選擇性地結合m6A修飾的mRNA，并將其招募到mRNA衰變位點來誘導轉錄本的降解。YTHDF1和YTHDF2在m6A修飾中發揮相反的作用，而YTHDF3既能夠與YTHDF1相互作用增強RNA翻譯，也能與YTHDF2聯合促進RNA降解[15]。YTHDC1參與RNA的剪接和輸出[16]，YTHDC2雖提高了目標RNA的翻譯效率，但降低了目標RNA的豐度[17]。研究發現，IGF2BPs蛋白能通過與m6A結合，增強RNA穩定性來促進RNA表達[18]；真核翻譯起始因子3能夠與mRNA在5′非翻譯區發生m6A甲基化修飾的區域結合，進而以不依賴帽的方式促進轉錄本的翻譯[19]；HNRNPA2B1能夠介導目標RNA的選擇性剪接，并與DGCR8(DiGeorge syndrome critical region 8)蛋白相互作用增強初級微RNA(microRNA，miRNA)加工[20]，而HNRNPC能參與前體mRNA的加工[21]。可見，m6A修飾與RNA識別蛋白之間復雜的相互作用可能在多個水平調控mRNA的表達。

2 m6A RNA甲基化修飾與泌尿系統腫瘤

科學工作者對m6A RNA甲基化修飾及其分子功能的研究已經擴展到許多人類疾病，特別是m6A介導的基因表達調控在癌癥中的作用。通常許多不同的信號通路匯聚到翻譯機制上，以滿足癌癥增加的合成代謝需求。鑒于m6A RNA甲基化修飾在mRNA代謝調控中的作用，可推測其在人類癌變中發揮重要作用。但關于m6A RNA甲基化修飾如何影響癌癥細胞表型仍在研究中。現分別介紹m6A RNA甲基化修飾的生物學功能及m6A調控蛋白在泌尿系統腫瘤(腎癌、膀胱癌、前列腺癌和睪丸癌)中的潛在分子機制。

2.1腎癌 腎細胞癌(renal cell carcinoma，RCC)是男性和女性最常見的腫瘤之一，分別在惡性腫瘤中占5%和3%[22]，其中腎透明細胞癌(clear cell renal cell carcinoma，ccRCC)是RCC最常見的組織學亞型，約占70%[23]。大部分腎癌在早期通過手術切除可以得到治愈。然而腎癌對化療和放療高度耐藥，復發性腎癌或轉移性腎癌除能夠手術切除局限性病灶外，尚無有效治療方法。

生物信息學分析顯示，5個m6A相關基因(ZC3H13、METTL14、YTHDF2、YTHDF3和HNRNPA2B1)在腫瘤組織中表達顯著下調，7個調控因子(YTHDC2、FTO、WTAP、METTL3、ALKBH5、RNA結合基序蛋白15和KIAA1429)在ccRCC中表達顯著上調[24]。因此，m6A甲基化調節因子可作為ccRCC患者預后分層的潛在生物標志物，并可幫助臨床醫師對該患者群體實現個體化治療。Zhou等[25]研究發現，甲基轉移酶基因的缺失和去甲基化酶基因的拷貝數增加使得m6A水平降低，這與ccRCC患者較差的臨床特征(包括生存率)存在明顯關系。另外，m6A調控基因的改變與VHL(Von Hippel-Lindau)、腫瘤蛋白p53的突變顯著相關；METTL3的低表達與脂肪形成和哺乳動物雷帕霉素靶蛋白通路的激活有關。Li等[26]證明，敲減METTL3基因會導致磷脂酰肌醇-3-激酶/蛋白激酶B/哺乳動物雷帕霉素靶蛋白通路磷酸化水平升高影響RCC的進展。METTL3的下調會促進細胞增殖、遷移、侵襲和上皮-間充質轉化，誘導G0/G1期阻滯、促進p21表達增加，從而促進RCC腫瘤的生長。MTC的另一關鍵酶METTL14可通過m6A甲基化修飾P2RX6(P2X purinoceptor 6)mRNA，抑制其蛋白翻譯，介導ATP-P2RX6信號軸，改變Ca2+內流，抑制磷酸化胞外信號調節激酶1/2-基質金屬蛋白酶9信號通路，阻止RCC細胞的遷移和侵襲[27]。此外，人第10號染色體缺失的磷酸酶及張力蛋白同源基因和真核翻譯起始因子3A的表達均與METTL14呈正相關[28]。METTL3-METTL14異源二聚體定位的關鍵酶WTAP在RCC腫瘤組織中表達上調，并與腫瘤大小、TNM分期以及患者預后相關[29]。且WTAP可以與細胞周期蛋白依賴性激酶2 mRNA 3′非翻譯區結合并穩定細胞周期蛋白依賴性激酶2轉錄本，提高細胞周期蛋白依賴性激酶2的表達，從而促進RCC細胞增殖。以上結果均表明，MTC中幾種關鍵甲基轉移酶在腎癌的發生發展中起重要的調控作用。

去甲基化酶FTO的低表達與腫瘤嚴重程度的增加和患者生存率降低有關[30]。過表達FTO能降低過氧化物酶體增殖物激活受體γ共激活因子1α mRNA的m6A水平、增強過氧化物酶體增殖物激活受體γ共激活因子1α mRNA的穩定性，使其表達增加，恢復VHL缺陷細胞線粒體活性，誘導氧化應激和活性氧類的產生，從而使腫瘤生長受限。研究發現，VHL和FTO在腎癌中能協同發揮致死作用，即抑制FTO能以不依賴缺氧誘導因子(hypoxia-inducible factor，HIF)的方式抑制VHL缺陷細胞的生長和存活[31]。這為研究m6A RNA甲基化修飾在腎癌中的作用提供了新方向。然而，另一種常見的去甲基化酶ALKBH5在腎癌組織中被檢測上調，并與患者的不良預后密切相關[32]。實驗表明，ALKBH5以依賴m6A的方式促進了Aurora激酶B mRNA發生去甲基化，增強了其穩定性，促進腎癌細胞增殖、侵襲和轉移，且缺氧誘導的HIF可以上調Aurora激酶B和ALKBH5的表達[32]。這表明，雖然FTO和ALKBH5的作用均使得RNA發生去甲基化，但它們在腎癌中的表達水平不同，靶向的RNA也不同，為m6A相關通路在腎癌中的研究提供了多種思路。Green等[33]將RNA的m6A甲基化修飾與RCC腫瘤細胞的代謝狀態聯系起來，發現線粒體單碳代謝酶MTHFD2能促進HIF-2 mRNA的m6A甲基化，導致HIF-2翻譯增強、表達增多，促進有氧糖酵解，MTHFD2和HIF-2在RCC中形成正反饋環，促進腫瘤的代謝和生長。因此，m6A修飾能夠通過不同的甲基化酶和去甲基化酶，調節不同目標靶基因RNA發生甲基化或去甲基化修飾，進而影響其穩定性并作用于下游通路，從而調節腎癌的發生發展，為腎癌的靶向治療提供新思路。

2.2膀胱癌 膀胱癌是泌尿生殖系統最常見的惡性腫瘤之一，其中移行細胞癌最為常見，占所有膀胱癌的90%以上[34]。根據腫瘤侵襲浸潤程度，膀胱癌可分為非肌層浸潤性膀胱癌和肌層浸潤性膀胱癌。非肌層浸潤性膀胱癌約占膀胱癌的75%，且10%～30%的非肌層浸潤性膀胱癌可進展為肌層浸潤性膀胱癌，肌層浸潤性膀胱癌的惡性程度較高，復發率較高，總體預后較差[34]。

膀胱癌患者的術后復發風險差異較大，部分患者復發風險較高。生物信息學分析顯示，包括METTL3在內的9個突變基因與膀胱癌復發呈顯著負相關[35]。這一發現可能有助于臨床輔助治療決策，對患者進行個體化監測以降低復發風險。研究發現，MTC的催化亞基METTL3在膀胱癌腫瘤組織中表達上調，且與膀胱癌的進展狀態相關[36]。體內利用化學致癌物促進尿上皮細胞的惡性轉化實驗和體外細胞實驗證實，METTL3催化了CUB結構域蛋白1(CUB domain-containing protein 1，CDCP1)mRNA上3′非翻譯區發生m6A修飾，增強YTHDF1與CDCP1 mRNA的結合，促進CDCP1 mRNA的修飾和翻譯[36]。同時，ALKBH5可以去甲基化CDCP1 mRNA，負向調控CDCP1蛋白表達。類似的作用在ITGA6 mRNA中也得到證實，且YTHDF1/YTHDF3能夠優先識別ITGA6 3′非翻譯區中的m6A修飾區域，促進ITGA6翻譯，增強膀胱癌細胞的生長和轉移能力[37]。METTL3還可以通過與微處理器蛋白DGCR8相互作用，增強對前體miR-221/222的識別和結合，并以m6A依賴的方式加速前體miR-221/222的成熟，減少人第10號染色體缺失的磷酸酶及張力蛋白同源基因的表達，從而在膀胱癌中發揮致癌作用[38]。且METTL3能直接介導AF4/FMR2家族成員4(AF4/FMR2 family member 4，AFF4)、核因子κB通路的兩個關鍵調節因子[核因子κB激酶亞單位β抑制劑(inhibitor of nuclear factor kappa-B kinase subunit beta，IKBKB)和轉錄因子p65]和骨髓細胞瘤病毒癌基因同源物(myelocytomatosis viral oncogene homolog，MYC)的m6A RNA甲基化修飾，促進膀胱癌的進展[39]。這在另一項研究中也得到證實，即METTL3-AFF4-SOX2(SRY-box transcription factor 2)/MYC信號軸通過m6A修飾參與維持膀胱癌干細胞的干性[40]。此外，AFF4可直接與MYC啟動子結合，促進其表達，表明METTL3下游有十分復雜的多級調控網絡[39]。研究發現，METTL3催化腫瘤抑制因子SETD7和Krueppel樣因子4 mRNA發生m6A修飾，YTHDF2對其進行識別，導致mRNA的衰變，促進膀胱癌進展[41]。MTC另一關鍵酶METTL14的表達水平在膀胱癌和膀胱腫瘤起始細胞中下降，并與臨床嚴重程度和預后相關[42]。METTL14以m6A RNA甲基化修飾方式靶向Notch1 mRNA穩定性抑制腫瘤發生和膀胱腫瘤起始細胞的自我更新能力，這可能成為消除膀胱腫瘤起始細胞的潛在靶點。上述研究表明，m6A甲基化酶METTL3和METTL4在膀胱癌中發揮十分重要的作用，而其他甲基化酶及去甲基化酶在膀胱癌中的作用尚不清楚。

2.3前列腺癌 前列腺癌是全球男性最主要的惡性腫瘤，對于晚期前列腺癌，特別是轉移性前列腺癌和去勢抵抗性前列腺癌，目前尚無絕對有效的治療方法[43]。生物信息學分析顯示，前列腺癌患者腫瘤與正常標本中m6A RNA甲基化調節因子的mRNA表達水平存在差異，50%的m6A甲基化識別蛋白和甲基轉移酶在腫瘤標本中高表達，而FTO、ALKBH5在腫瘤標本中低表達[44]。該研究進一步通過單變量和多變量Cox回歸分析發現，IGF2BP3、HNRNPA2B1、METTL14和ALKBH5與前列腺癌患者的無復發生存率顯著相關。說明mRNA中高水平的m6A甲基化，影響蛋白亞細胞定位，促進前列腺癌的進展，使得患者生存獲益較差。MTC的催化亞基METTL3在前列腺癌腫瘤組織中表達上調，它能促進癌細胞的增殖和侵襲，這一調控作用依賴于METTL3 m6A的催化活性；進一步的機制分析表明，METTL3通過m6A修飾GLI1 mRNA，介導SHH(Sonic hedgehog)-GLI通路調控前列腺癌細胞凋亡[45]。且METTL3也能促進淋巴增強子結合因子1(lymphoid enhancer-binding factor 1，LEF1)mRNA的m6A甲基化，使得LEF1在前列腺癌中表達上調[46]。同時IGF2BP2與m6A修飾的LEF1 mRNA相互作用，延長了LEF1 mRNA的半衰期，從而上調LEF1蛋白水平。METTL3-LEF1信號軸影響Wnt通路的活性，進而促進前列腺癌的進展。另一項研究表明，METTL3能提高ITGB1 mRNA的穩定性，使得ITGB1表達增加，從而增強前列腺癌細胞對Ⅰ型膠原的黏附性和遷移能力，促進癌細胞的骨轉移[47]。同時，METTL3-m6A依賴性機制也能調控HuR基因介導的ITGB1 mRNA的穩定性。且METTL3還能通過m6A甲基化修飾與MYC mRNA相互作用，調控MYC表達，促進前列腺癌細胞的增殖、遷移和侵襲[48]。這些結果均表明，METTL3可能是人類前列腺癌的一個潛在預后生物標志物。

甲基化識別蛋白YTHDF2在前列腺癌組織和細胞系中表達均上調，且過表達YTHDF2會顯著抑制整體m6A甲基化，促進前列腺癌細胞的增殖和遷移[49]。此外，miR-493-3p能夠直接靶向YTHDF2。進一步試驗證實，YTHDF2的表達會被miR-493-3p抑制，進而抑制前列腺癌細胞的增殖和遷移[49]。鑒于此，METTL3-YTHDF2對RNA的作用也被證實，METTL3能夠促進前列腺癌腫瘤組織中LHPP(phospholysine phosphohistidine inorganic pyrophosphate phosphatase)和NKX3-1(homeobox protein Nkx-3.1)發生m6A RNA甲基化修飾，隨后被YTHDF2識別并降解，進而激活下游通路蛋白激酶B的磷酸化[50]。因此，m6A修飾為前列腺癌的致癌作用和新的潛在治療靶點提供了新視角，但對m6A其他甲基轉移酶和去甲基化酶在前列腺癌中的作用研究較少。

2.4睪丸癌 睪丸癌約占全球男性癌癥的1%，是年輕人(15～40歲)最常見的實體瘤，其發病率呈上升趨勢[43]。睪丸生殖細胞瘤(testicular germ cell tumors，TGCTs)是睪丸癌患者的主要組織學類型，約占95%，其又分為精原細胞瘤和非精原細胞瘤，其中精原細胞瘤較非精原細胞瘤略常見。

生物信息學分析顯示，VIRMA/KIAA1429和YTHDF3是TGCTs中最常改變的兩個m6A相關基因，分別占52%和48%[51]。它們在TGCTs亞型中表達不同，與非精原細胞瘤相比，VIRMA/KIAA1429和YTHDF3在精原細胞瘤中顯著過表達，且兩者呈正相關，這可能為患者管理提供新的候選生物標志物，從而進一步闡明TGCTs的生物學和臨床行為。研究發現，MTC催化亞基METTL3和甲基化識別蛋白IGF2BP1在精原細胞瘤中通過轉錄因子激活增強TFAP2C發生m6A甲基化，從而抵抗順鉑治療的耐藥性[52]。這為精原細胞瘤患者增強化療療效提供可能的靶點。然而與其他泌尿系統腫瘤相比，m6A RNA甲基化修飾在睪丸癌中的研究十分有限，為闡明其發生發展的分子機制及指導未來的臨床治療還需進一步的研究。

3 結 語

研究m6A RNA甲基化修飾在泌尿系統腫瘤中的作用，有助于揭示腫瘤發生內在分子機制，對早期診斷、治療以及指導預后具有重要意義。MTC中關鍵亞基METTL3在腎癌、膀胱癌、前列腺癌和睪丸癌中均發揮重要的調控作用，而甲基轉移酶METTL14和WTAP的作用也不容忽視。去甲基化酶FTO和ALKBH5發揮與甲基轉移酶相互拮抗的作用，對腫瘤進展也十分關鍵。然而，m6A RNA甲基化修飾其他分子尤其是甲基化識別蛋白在泌尿系統腫瘤中的分子機制和細胞效應尚不完全清楚，且不同或相同的甲基轉移酶或去甲基化酶并不總是以相同的方式發揮作用。同時，m6A RNA甲基化修飾調控分子在泌尿系統腫瘤中的異常表達機制也尚不清楚，因此需要開發新的基于m6A RNA甲基化修飾調控的腫瘤治療方法，需要對每種泌尿系統腫瘤類型以及不同病理分型進行更深入的研究。