circRNA在心肌缺血再灌注損傷中的研究進展

田立群，黃琴，夏中元

(武漢大學人民醫院麻醉科，武漢 430060)

環狀RNA(circular RNA，circRNA)于20世紀70年代初首次被發現[1]，但迄今為止關于circRNA的報道并不多見。近年來，高通量轉錄組測序技術和計算算法的發展使circRNA在動物體內的普遍性得到證實[2-3]。與其他種類RNA不同，circRNA由反向剪接產生，是一種缺乏游離3′端和5′端共價閉合的環狀分子，可分為外顯子circRNA、外顯子-內含子circRNA和內含子circRNA三類[3-5]。circRNA一直被認為是異常剪接的副產物，但目前越來越多的研究發現circRNA具有復雜的生物學功能，如“海綿”微RNA(micorRNA，miRNA)、與蛋白質相互作用、調節親本基因的表達、翻譯等[4,6-10]。circRNA與神經系統疾病、退行性疾病、腫瘤和心血管系統疾病等密切相關[11]。臨床上常通過血運重建治療缺血性心臟病，而恢復血運的心肌仍可能遭受心肌細胞壞死、組織結構紊亂等進一步損害，即心肌缺血再灌注損傷[12-13]。心肌缺血再灌注損傷造成的損傷面積可達全部心肌梗死面積的50%[14]。因此，解決這一難題在臨床上具有十分重要的意義。多項研究在心肌缺血再灌注損傷過程中檢測到circRNA差異表達，表明circRNA可能參與心肌缺血再灌注損傷的過程[15-17]。現就circRNA在心肌缺血再灌注損傷中的研究進展予以綜述。

1 circRNA概述

1.1circRNA的生物發生和分類 前體信使RNA通過規范剪接去除內含子生成可作為翻譯模板的成熟信使RNA，這種剪接模式主要通過識別內含子3′端一個特征性AG位點和內含子5′端一個GU位點來實現[18]。circRNA是一種共價閉合的環狀分子，沒有3′端“多聚腺苷尾”和5′端“帽子結構”，主要通過反向剪接產生，與規范剪接不同，反向剪接通常不需要特定的順序，但需要側翼內含子元件之間的堿基配對[19]。Jeck等[20]通過生物信息學分析發現，外顯子環化需要含有互補ALU重復序列的長邊界內含子；此外，規范剪接得到的信使RNA中外顯子的相對順序與基因組中外顯子的順序相匹配，但反向剪接涉及測序讀數中外顯子順序的破壞。

根據來源不同circRNA可分為3類，其中外顯子circRNA源于外顯子序列，主要存在于細胞質，占circRNA的大多數[3]；外顯子-內含子circRNA兼具外顯子和內含子序列，被認為是生成外顯子circRNA的中間產物，位于細胞核內[5]；內含子circRNA僅由內含子組成，大多存在于細胞核內[4]。外顯子circRNA具有多種功能，其中研究最多的是miRNA的“分子海綿”作用，而內含子circRNA幾乎不具備此功能[4]。外顯子-內含子circRNA和內含子circRNA主要存在于細胞核內，可以影響基因的轉錄過程[4,5]。

1.2circRNA的生物學功能

1.2.1充當miRNA“海綿” circRNA的生物學功能中研究最多的是circRNA對miRNA的“海綿”作用，即circRNA與miRNA堿基互補配對，干擾miRNA使其無法與相應靶標結合，影響其對下游靶基因的調控。例如，心臟相關circRNA可通過靶向結合miR-223促進胱天蛋白酶(caspase)募集結構域的表達，抑制心臟肥大和心力衰竭[21]。circRNA可以包含單個miRNA的多個結合位點，如小腦變性相關蛋白1反義轉錄物(cerebellar degeneration-related protein 1 antisense，Cdr1as)轉錄生成的circRNA Cdr1as分子在哺乳動物大腦中高表達，含有約70個miR-7結合位點，可以吸附miR-7并降低其活性，導致相應靶標水平升高[2]。此外，circRNA也可對多種不同的miRNA起“海綿”作用，如circ-HIPK3(homeodomain-interacting protein kinase 3)可以結合多種miRNA(miR-124、miR-152、miR-193a、miR-29a、miR-29b、miR-338、miR-379、miR-584和miR-654)，從而調控多個靶基因的表達[22]。

1.2.2與蛋白質相互作用 盲肌樣蛋白(muscle blind，MBL)基因的第2個外顯子在果蠅和人類中被環化成circRNA，即circMBL[8]。Ashwal-Fluss等[8]發現，circMBL含有保守且特異的MBL結合位點，當MBL含量豐富時，circMBL通過與MBL結合減弱其生物利用度。circRNA不僅能直接影響蛋白質含量，還可影響蛋白質的亞細胞定位。例如，由叉頭框轉錄因子O3(forkhead transcription factor O3，FoxO3)基因環化產生的circ-FoxO3主要分布在細胞質中，可與細胞分化抑制因子-1、E2F轉錄因子1以及黏著斑激酶和缺氧誘導因子-1α相互作用，使細胞分化抑制因子-1、E2F轉錄因子1、缺氧誘導因子-1α不能進入細胞核，因此黏著斑激酶不能進入線粒體發揮作用，最終導致細胞衰老加重[9]。另外，circRNA還可充當蛋白質支架，促進蛋白質之間的相互作用。Du等[23]發現，circ-FoxO3可以與細胞周期蛋白依賴性激酶2和p21相互作用形成三元復合物，使細胞質中p21和細胞周期蛋白依賴性激酶2間的相互作用增強，從而阻止細胞周期蛋白依賴性激酶2與細胞周期蛋白A和細胞周期蛋白E的相互作用以及隨后的細胞周期進程。

1.2.3調節親本基因的表達 多種位于細胞核的circRNA可通過調節RNA聚合酶Ⅱ影響親本基因的轉錄。RNA和蛋白質的共鑒定結果表明，源自錨蛋白重復結構域52(ankyrin repeat domain 52,ANKRD52)基因的ci-ANKRD52可與RNA聚合酶Ⅱ復合體結合，而敲低ci-ANKRD52的表達，ANKRD52基因轉錄水平則下調；另一個由沉默信息調節因子7(silent information regulator 7，SIRT7)基因環化產生的內含子circRNA-ci-SIRT7也以相同機制調節組蛋白去乙?；?基因的表達[4]。這項研究表明，某些circRNA可充當RNA聚合酶Ⅱ轉錄的正向調節劑，在其親本基因的有效轉錄中發揮作用。

綜上，某些位于細胞核內的circRNA可以在轉錄水平影響親本基因的表達。而外顯子circRNA通過合成時的反向剪接與前體信使RNA的規范剪接形成競爭，在剪接水平影響基因表達[24]。例如，circMBL的反向剪接與MBL前體信使RNA的規范剪接相互影響，當MBL表達過量時，circMBL的反向剪接增強，circMBL產生增加，而MBL前體信使RNA的規范剪接減弱時，則自身信使RNA的產生減少[8]。

1.2.4翻譯多肽或蛋白質 circRNA缺乏帽依賴性翻譯的必需元件，如3′端“多聚腺苷尾”和5′端的“帽子結構”，通常被認為不具備翻譯功能[25]。事實上，早在1995年Chen等[26]就發現circRNA具有內部核糖體插入位點，并對circRNA的編碼功能進行了初步描述。部分circRNA可以翻譯功能性蛋白質或多肽。例如，circZNF609是源于鋅指蛋白609(zinc finger protein 609，ZNF609)基因第2外顯子的單外顯子circRNA，包含一個開放閱讀框，該框的長度與線性轉錄本相同，自起始密碼子始，終止于在環化過程中創建的框內STOP密碼子，通過多核糖體分析發現，circZNF609與重鏈多核糖體組分結合，并以剪接依賴性的方式翻譯蛋白質[10]。由SHPRH(SNF2 histone linker PHD RING helicase)基因環化產生的circ-SHPRH使用重疊的遺傳密碼生成“UGA”終止密碼子，實現SHPRH-146aa的翻譯，SHPRH-146aa保護全長SHPRH免受泛素蛋白酶體的降解，具有腫瘤抑制劑的功能[27]。circ-F框/WD-40域蛋白7(F-box and WD-40 domain protein 7,FBXW7)可由內部核糖體插入位點驅動開放閱讀框編碼一種新的蛋白質——FBXW7-185aa，FBXW7-185aa可以協同親本基因FBXW7，降低c-Myc蛋白的表達，促進c-Myc的泛素化降解，從而抑制膠質瘤的發生[28]。預計有多個circRNA序列包含一個由內部核糖體插入位點驅動的開放閱讀框[29]，但目前只有少部分的circRNA被證實可做翻譯模板，未來還需更多的研究探索circRNA的這一生物學功能。

2 circRNA與心肌缺血再灌注損傷

2.1circRNA與心肌缺血再灌注過程中的心肌細胞損傷

2.1.1circRNA與心肌缺血再灌注過程中的心肌細胞自噬 自噬是通過溶酶體降解清除受損細胞器的過程，對細胞穩態起重要作用，但過度的自噬激活會損壞大量細胞器，導致細胞壞死。在心肌缺血再灌注損傷的不同時期，自噬具有不同的作用，在缺血期適度的自噬可起到自我保護作用，而在再灌注期自噬過度激活則可導致進一步的細胞損傷，甚至導致細胞壞死[30]。因此，探討心肌細胞自噬的機制可能為心肌缺血再灌注損傷的治療提供新思路。Gan等[17]通過在體外對心肌細胞進行缺氧/復氧處理模擬心肌缺血再灌注過程，結果發現，circRNA_101237水平在心肌細胞中顯著升高，circRNA_101237小干擾RNA轉染可減弱缺氧/復氧介導的自噬激活。circRNA_101237還可通過充當let-7a-5p的“海綿”調節胰島素樣生長因子2信使RNA結合蛋白3的表達，而胰島素樣生長因子2信使RNA結合蛋白3進一步通過調節胰島素樣生長因子2激活磷脂酰肌醇-3-激酶/蛋白激酶B通路，參與自噬和凋亡[31]。自噬相關circRNA在缺氧/復氧或缺血再灌注的心肌細胞中顯著下調，機制研究發現，自噬相關circRNA與DNA甲基轉移酶3B直接結合激活了人第10號染色體缺失的磷酸酶及張力蛋白同源基因誘導激酶1的表達，而人第10號染色體缺失的磷酸酶及張力蛋白同源基因誘導激酶1可使下游FAM65B(the family with sequence similarity 65，member B)的46位絲氨酸磷酸化，抑制心肌細胞的自噬和細胞凋亡[32]。Jin等[33]發現，與心肌缺血再灌注組相比，在心肌缺血再灌注前使用毛柳苷預處理可使circ-0000064表達顯著升高，在心肌缺血再灌注前circ-0000064過表達則可通過抑制自噬來保護心肌細胞，減輕心肌缺血再灌注損傷。以上研究表明，心肌缺血再灌注可以誘導心肌細胞circRNA表達模式的變化，部分circRNA通過“海綿”miRNA調控靶蛋白或直接作用于靶蛋白調控自噬通路，最終在心肌缺血再灌注損傷中起作用。通過靶向circRNA藥物干預心肌細胞的自噬通路，可為減輕心肌缺血再灌注損傷提供新的干預措施和治療手段。

2.1.2circRNA與心肌缺血再灌注過程中的心肌細胞凋亡 心肌缺血再灌注過程中心肌細胞的過度凋亡是導致心肌再次損傷的重要原因，但具體機制目前尚不明確。circ膜聯蛋白A2和circHIPK3在模擬心肌缺血再灌注過程的心肌細胞中高表達，分別通過“海綿”miR-133和miR-1243p來抑制miR-133和miR-1243p的活性，促進心肌細胞凋亡[16,34]。另有研究發現，心肌缺血再灌注后，circ-0068566在心肌細胞中的表達顯著下調，circ-0068566可靶向hsa-miR-6322/聚腺苷二磷酸核糖聚合酶-2通路發揮作用，上調circ-0068566可減輕缺血再灌注引起的心肌細胞凋亡[35]。上述研究結果表明，心肌缺血再灌注可引起心肌細胞circRNA表達譜的改變，而circRNA的上調或下調可通過靶向調控miRNA促進或抑制心肌缺血再灌注過程中的心肌細胞凋亡。

2.1.2.1circRNA與凋亡的線粒體通路 線粒體是細胞凋亡的調控中心，而凋亡的線粒體通路是指各種刺激引起線粒體外膜通透性增加，細胞色素C釋放進入胞質，與細胞凋亡蛋白酶活化因子-1結合，激活caspase，引起級聯反應，導致細胞凋亡[36]。研究表明，circRNA/miRNA/靶基因軸可能通過凋亡的線粒體通路參與心肌缺血再灌注損傷[15,37]。線粒體分裂與凋亡相關的circRNA在缺氧/復氧或缺血再灌注的心肌細胞中顯著升高，通過直接靶向下調miR-652-3p，降低miR-652-3p對MTP18(mitochondrial protein 18 kDa)翻譯的抑制作用[15]。MTP18是一種核編碼的線粒體膜蛋白，有助于哺乳動物細胞中的線粒體裂變，線粒體過度分裂可導致線粒體外膜通透性增加以及細胞色素C等凋亡觸發因子釋放，激活caspase，誘導細胞凋亡[38]。研究發現，circRNA-4087在心肌缺血再灌注過程中顯著上調，circRNA-4087可與miR-16結合調控細胞凋亡，circRNA-4087過表達可導致線粒體功能障礙以及caspase-3、Bcl-2相關X蛋白等促凋亡蛋白表達顯著上調，而下調的circRNA-4087可增加心肌細胞內腺苷三磷酸的含量，降低線粒體活性氧類的生成，抑制心肌細胞凋亡[37]。

2.1.2.2circRNA與凋亡的內質網通路 內質網是蛋白質合成、折疊修飾、脂質代謝以及維持細胞內鈣離子穩態的重要場所。缺血、缺氧、氧化應激、高糖、高脂等均可導致內質網功能異常，引起未折疊蛋白聚集，導致未折疊蛋白反應，引發內質網應激以恢復內質網穩態，應激因素過強或持續存在，會導致內質網穩態失衡，當細胞本身不能應對這些異常時會過度活化內質網應激，導致細胞凋亡[39]。Geng等[40]發現，Cdr1as/miR-7a軸在心肌梗死小鼠模型中被激活，并促進心肌細胞凋亡。miR-7a/b在大鼠心肌缺血再灌注損傷中的表達上調，在miR-7a模擬物轉染的心肌缺血再灌注損傷模型中，大鼠心肌細胞凋亡水平和心肌梗死面積均顯著降低[41]。在培養的新生大鼠原代心肌細胞中，模擬缺血或缺血再灌注可以激活未折疊蛋白反應[42]。miR-7a過表達可以激活未折疊蛋白反應期間轉錄激活因子4/CCAAT增強子結合蛋白環腺苷酸反應元件結合轉錄因子同源蛋白信號通路，且可顯著降低心肌細胞中內質網應激誘導的細胞凋亡[43]。上述研究表明，Cdr1as/miR-7a軸可能通過內質網應激通路促進缺血再灌注導致的心肌細胞凋亡，但具體作用機制尚待實驗驗證。

2.1.2.3circRNA與凋亡的死亡受體通路 死亡受體是腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor，TNF)受體超家族的一部分，死亡受體通過與相應配體的結合，調節細胞凋亡的信號轉導。凋亡相關因子受體/凋亡相關因子配體和TNF受體/TNF-α是目前研究最多的死亡受體通路。Li等[44]研究發現，circ-鈉鈣交換體亞型1(sodium/calcium exchanger 1，NCX1)可與miR-133a-3p結合，降低miR-133a-3p對細胞死亡誘導蛋白1(cell death-inducing protein 1，CDIP1)基因的抑制活性，增加細胞對活性氧類的反應，促進心肌細胞凋亡；在小鼠心肌細胞和心臟組織中敲除circNCX1可以降低CDIP1水平，并減輕細胞凋亡和心肌缺血再灌注損傷。CDIP1是促凋亡信號轉導子，當細胞受到應激時，CDIP1可上調TNF-α，將死亡受體介導的外在凋亡信號傳遞到細胞內，促進細胞凋亡[45]，表明circNCX1/miR-133a-3p/CDIP1軸可能通過死亡受體通路促進心肌缺血再灌注損傷。另有研究發現，circ-擾動樣激酶1(tousled-like kinase 1，TLK1)在心肌缺血再灌注小鼠模型中過表達，下調circ-TLK1可導致miR-214在心肌缺血再灌注小鼠體內過表達，進而抑制受體相互作用蛋白激酶1和TNF信號通路，顯著降低心肌細胞凋亡和心肌組織損傷[46]。

綜上所述，circRNA可能通過調節心肌細胞自噬或凋亡參與心肌缺血再灌注損傷。自噬可以通過降解異常蛋白質、受損的內質網和線粒體來維持細胞穩態，但自噬的過度激活則可導致各種細胞凋亡通路被激活[47]。細胞凋亡的通路也并非完全獨立，凋亡的線粒體通路、內質網應激通路和死亡受體通路最終都是通過激活下游的caspase家族蛋白酶發揮作用，同時這3條通路還可通過多個反饋回路相互調節[48]。因此，探索circRNA在心肌細胞自噬和凋亡中的具體機制，有助于為靶向circRNA治療心肌缺血再灌注損傷提供理論依據。

2.2circRNA與心肌缺血再灌注過程中的血管內皮細胞功能障礙 冠狀動脈微循環負責為組織提供氧氣和營養、去除代謝廢物、控制炎癥和損傷修復以及進行與組織間的液體交換。血管內皮細胞功能障礙以細胞因子、趨化因子等炎癥因子的過度產生和細胞遷移、凋亡的改變為特征，是冠狀動脈微循環障礙的重要因素。急性心肌缺血再灌注可誘導內皮細胞功能障礙，造成冠狀動脈微循環損害，加重心肌損傷[49]。然而，目前關于心肌缺血再灌注誘導的內皮細胞功能障礙方面的研究較少，因此，探討心肌缺血再灌注過程中血管內皮功能障礙的相關機制，可以為減輕心肌缺血再灌注損傷提供新的治療策略。

circRNA可能與心肌缺血再灌注誘導的血管內皮功能障礙的發生相關。Chen等[50]發現，再灌注可致血管內皮細胞中含E6-AP C端(HECT)結構域的E3泛素連接酶1[E6-AP C-terminal(HECT)domain-containing E3 Ub ligase 1，HECTD1]的表達顯著降低，同時血管內皮細胞遷移和凋亡增加，上調HECTD1在內皮細胞中的表達可顯著減輕心肌缺血再灌注誘導的內皮細胞遷移和凋亡；生物信息學分析結果顯示，HECTD1基因的3′非編碼區與miR-143有結合位點，而miR-143和circ DLGAP4(discs large associated protein 4，DLGAP4)也有結合位點；再灌注1 h后，內皮細胞的circDLGAP4表達顯著降低，而miR-143表達增加2.5倍，內皮細胞過表達circDLGAP4可減輕再灌注12 h引起的HECTD1蛋白表達的下調，表明circDLGAP4通過海綿miR-143調節HECTD1的表達，在血管內皮細胞的遷移和凋亡中起重要作用，參與心肌缺血再灌注損傷的調節。另有研究發現，在心肌缺血再灌注模型中，circRNA-100338在冠狀動脈內皮細胞中的表達顯著下調；進一步用人臍靜脈內皮細胞構建體外缺氧/復氧模型進行機制研究發現，circRNA-100338可能通過與miR-200a-3p結合抑制miR-200a-3p的功能來調控肉瘤融合蛋白，進而調節血管內皮細胞遷移和管狀形成[51]。上述研究為心肌缺血再灌注損傷機制的研究提供了新的方向和思路，circRNA在心肌缺血再灌注損傷中的作用不僅局限于心肌細胞，也存在于血管內皮細胞，對相關機制的深入研究還可為臨床治療提供新的靶點，為理想治療藥物的開發提供支持。

3 小 結

circRNA具有組織特異性、種類繁多、性狀穩定、功能復雜等特點，這些特性使circRNA有望成為心肌缺血再灌注損傷理想的生物標志物和潛在的治療靶點。心肌缺血再灌注損傷的病理機制目前仍不完全清楚，且缺乏有效的防治方法，而circRNA在心肌缺血再灌注損傷方面的研究還處于初始階段。由于circRNA表達譜在心肌缺血再灌注過程中發生變化，且circRNA功能復雜多樣，因此哪些circRNA在心肌缺血再灌注損傷中起關鍵作用目前尚未可知。未來仍需進一步探索circRNA在心肌缺血再灌注損傷中的病理機制以及circRNA的調控機制，以期為臨床上靶向circRNA防治心肌缺血再灌注損傷提供理論依據。