環狀RNA在部分家畜生長發育調控方面的研究進展

楊青林，張藝鳴，張硯池 ，張燕軍,2,3,4*

（1.內蒙古農業大學動物科學學院，內蒙古 呼和浩特 010018；2.農業農村部肉羊遺傳育種重點實驗室，內蒙古 呼和浩特 010018；3.內蒙古自治區動物遺傳育種與繁殖重點實驗室，內蒙古 呼和浩特 010018；4.內蒙古自治區山羊遺傳育種工程技術研究中心，內蒙古 呼和浩特 010018）

1 引言

circRNA是一類特殊的非編碼RNA分子，與傳統的線性 RNA （linear RNA，含 5′和 3′末端）不同，circRNA分子呈封閉環狀結構，不受RNA外切酶影響，表達更穩定，不易降解。廣泛存在于多種生物細胞中，具有結構穩定、序列保守及細胞或組織特異性表達等特征［1］。這種RNA的發展歷程十分艱辛。circRNA最早發現于20世紀70年代。1976年，人們利用電鏡等技術在植物感染的類病毒 (Viroids)及副流感病毒(Sendaivirus)顆粒中首次觀察到circRNA。之后，研究人員又在動物細胞和真菌酵母中發現了circRNA，但是由于生物技術的局限性和結構的特殊性，circRNA在當時被認為是錯誤剪接或剪接過程中形成的副產物,并定義為沒有研究意義。隨著21世紀的到來，RNA-seq技術和應用的快速發展，使研究者加深了對非編碼RNA世界的印象，一類廣泛存在于多種生物細胞中并具有多種調控作用的新型內源性非編碼RNA-circRNA逐漸受到人們的關注。

circRNA有以下五個生物學功能：（1）與典型剪接發生競爭[2]；（2）充當 miRNA 分子的“海綿”[3]；（3）調控基因的轉錄[4-5]；（4）與蛋白質結合，調控蛋白活性[6]；（5）翻譯為蛋白質[7]。目前，circRNA研究主要集中在人體疾病，比如癌癥、腫瘤等醫學方面。近年來，對各種家畜的研究也逐漸增多，主要集中在circRNA的信息挖掘，關于其作用機理的研究也在慢慢深入。同時,circRNA的更多生物學功能亦有待進一步探索。本文綜述了circRNA在部分家畜生長發育中的調控作用，以期為研究家畜組織中circRNA的功能提供理論依據與研究思路。

2 circRNA在羊生長發育調控方面的研究

circRNA參與了羊胚胎、腦垂體、肌肉和骨骼肌等組織器官的生長發育調控。在這個過程中，circRNA主要通過充當miRNA的海綿來發揮調控作用，從而影響各種組織的生長發育。

2.1 circRNA在胚胎方面的研究

在細胞發育過程中，circRNA在細胞增殖、分化、自噬和凋亡等方面發揮著重要作用。La Y等[8]發現，在粗毛羊和細毛羊的卵泡期和黃體期分別有147個和364個差異表達的circRNAs。這些來源基因主要涉及與生殖和能量代謝有關的雌激素信號通路、轉化生長因子β信號通路、促性腺激素釋放激素信號通路、催產素信號通路、磷酸戊糖途徑、淀粉和蔗糖代謝等。

Liu等[9]以漢珀羊為研究對象，發現183個circRNAs在卵泡期單胎綿羊和卵泡期多胎綿羊中存在差異表達。黃體期單胎綿羊與黃體期多胎綿羊中有34個circRNA差異表達。這些功能通過EGF-EGFR-RASJNK、tgf-β和甲狀腺激素信號通路影響漢珀羊的產羔數。 Tao等[10]在波爾山羊和麻城黑山羊中，共檢測到37個circRNAs基因的差異表達。發現Chi-circ-0008219參與了一個巨大的circRNA-miRNA-mRNA共表達網絡；且通過熒光素酶活性測定，觀察了Chicirc-0008219對3種卵泡相關miRNAs的吸附作用。綜上所述，這些研究結果表明，circRNA對綿羊胚胎發育具有潛在的影響，而這將決定羊的經濟效益。

2.2 circRNA在腦垂體方面的研究

垂體腺是動物最重要的內分泌器官，主要通過調節激素的合成來調節動物的發情。Li X等[11]在綿羊發情期和乏情期腦垂體系統中共鑒定了12468個和9231個差異表達的circRNAs，并證實了部分差異表達的circRNA。豐富了涉及發情相關術語和通路調控的circRNA。Li等[12]通過對產前和產后綿羊腦垂體中RNA-seq數據的鑒定，發現了10226個circRNAs。他們的研究結果表明，綿羊circRNA對RNaser消化具有抗性，并在出生前后的垂體腺中表達。差異表達的circRNA的宿主基因參與了激素分泌的調節以及與這些過程相關的幾個途徑。確定了許多circRNA和參與腦垂體生物功能的腦垂體特異性miRNA的相互作用。

2.3 circRNA在肌肉方面的研究

Li等人[13]在胚胎和成年綿羊背最長肌肉中成功地識別了6113個circRNAs。在研究中篩選出了綿羊出生前后肌肉組織中差異表達的circRNA，發現了一些circRNA參與了肌肉生長發育的調節。此外，他們在這次的研究中意外地發現了一些circRNA，同時包含不同miRNA的多個靶位點。Cao等人[14]發現，許多circRNAs與肌肉特異性miRNA相互作用，circRNA的承載基因與肌肉細胞發育和信號通路有關。趙薇博士[15]在山羊背最長肌的6個發育時期共鑒定出14655個circRNAs。其中有6276個circRNAs在6個發育階段共表達，共有1336個circRNAs的表達量在不同發育階段兩兩之間存在顯著差異。此外還發現，circRNA與miRNA的結合呈現“多對多”的關系且結合位點數在circRNA中呈現不均等分布。這些研究結果說明，肌肉的生長發育受到circRNA的影響。

2.4 circRNA在骨骼肌方面的研究

石田培等[16]通過研究首次獲得綿羊胚胎骨骼肌發育的全轉錄組圖譜，并找到快慢肌轉換的關鍵轉錄物circRNA7527以及與肌細胞增殖分化相關的核心轉錄因子circRNA17939、circRNA2324和circRNA19073等。Ying等[17]首次揭示了山羊骨骼肌中circRNA時序動態表達模式，發現多個基因都產生了不同circRNA亞型，表明circRNA具有多樣性及其調控機制的復雜性。他們在這里首次通過RNA-seq描述了山羊骨骼肌7個發育階段中的circRNA表達譜，并描述了SDECs的時間模式。聶露等[18]發現，circCDR1as在胚胎發育中期骨骼肌中呈現極顯著的高表達，并且發現CDR1as與miR-7有70個保守的結合位點。CDR1as過表達可以抑制miR-7mimics對SMSCs的分化，說明CDR1as可能通過競爭性結合miR-7,阻礙IGF1R下調來促進SMSCs分化。CaoYang等[19]從綿羊骨骼肌中鑒定了886個circRNA，提供了綿羊骨骼肌中circRNA的全面表達譜。

3 circRNA在牛生長發育調控方面的研究

circRNA參與了牛胚胎、大腦組織、肌肉、脂肪和乳腺等方面的生長發育調控。主要以參與各種信號通路和抑制或干擾基因表達來調控各組織的生長發育。

3.1 circRNA在胚胎方面的研究

Gao Y等人[20]在秦川牛新生期和成年期睪丸中檢測到了21753個circRNAs。并進一步研究了牛睪丸circRNA的基因組特征、長度分布及其他特征。王晶晶等[21]以青年母牛為研究材料獲得牛體內囊胚約887個circRNAs，并且以CLASSIC為主要類型。而這種剪切方式會形成成環的外顯子circRNA。 Su X等人[22]的研究表明，異常的circRNA表達可能在胎盤結構和功能障礙中起多種作用。

3.2 circRNA在大腦組織方面的研究

鄭磊等[23]在西藏牛和三江牛大腦組織中低氧適應相關circRNA的研究中共篩選了差異顯著的858個circRNAs。所篩選出的858個circRNAs主要與MAPK信號通路、谷氨酸能突觸、Rap1信號通路、磷脂酶D信號通路以及cGMP-PKG信號通路等有關。

3.3 circRNA在肌肉方面的研究

魏雪鋒等[24]在秦川牛90天胎牛和24月齡成年牛肌肉中得到了12981個候選circRNAs，并發現circRNA42在肌肉發育過程中下調程度最大，暗示其在肌肉發育中可能具有重要功能。表明circLMO7有能夠促進肌細胞增殖和抑制肌細胞分化和肌管產生的功能。與此同時，Wei等[25]進一步研究表明，過度表達的circLMO7，抑制了牛原代成肌細胞的分化，其參與牛的肌肉發育，可增加細胞周期s期成肌細胞的數量，降低G0/G1期細胞比例，促進成肌細胞增殖，保護成肌細胞。 Li等[26-27]分析了秦川牛胚胎時期和成年時期牛肌肉組織中差異表達的circFGFR4、circFUT10。通過試驗觀察到circFGFR4能吸附miRNA-107，circFGFR4的過度表達增加了Wnt3a的表達，而這種效應被miRNA-107所消除。表示circFUT10、circFGFR4的表達在肌肉組織中的調節可能成為控制牛肌肉發育的繁殖策略中的潛在目標。Xiao等人[28-29]通過秦川牛胚胎時期和成年牛肌肉組織中差異表達的circRNA-circTTN研究發現，過表達的circTTN能夠促進牛成肌細胞的增殖及分化，相反，干擾circTTN抑制了牛成肌細胞的增殖及分化。

Huang等人[30]研究了造成牛與水牛肌肉品質差異的circRNA分子調控機制，他們共檢測到10449個circRNAs候選基因，其中1128個在牛和水牛肌肉組織庫中有差異表達。經過體內研究表明，新的調節因子circEch1能夠誘導成肌細胞分化和骨骼肌再生。

3.4 circRNA在脂肪方面的研究

蔣瑞等[31]對秦川牛不同發育時期脂肪組織中circRNA的表達分析表明，在犢牛和成年牛中共檢測到14274個circRNAs。通過進一步研究發現，circFUT10促進牛脂肪細胞增殖和抑制牛脂肪細胞分化，也通過吸附let-7c來促進脂肪細胞增殖,抑制其分化，進而調控秦川牛脂肪細胞的增殖和分化。Yongfeng等人[32]在牦牛脂肪細胞分化過程中首次確定了circRNA的表達模式。他們檢測到7203個circRNAs候選基因在脂肪細胞分化后第12天有136個circRNAs差異表達，第0天有7個circRNAs差異表達，并且發現了6個與脂肪細胞分化相關的circRNA。

3.5 circRNA在乳腺方面的研究

Chun等[33]研究產后90、250天的奶牛乳腺組織中差異表達的circRNA，發現circRNA包含許多miR-2284家族結合位點，可以作為miR-2284海綿調節酪蛋白的翻譯。 YanHong等[34]從牛奶外泌體中鑒定出2059個不同的circRNAs，其中大多數在初乳或成熟牛奶外泌體中表達，且圖譜差異很大。由于牛奶外泌體中的RNA可以被吸收并在接收細胞中發揮作用，這些RNA可能作為一種新的調節營養物質供嬰幼兒和成年消費者使用。

4 circRNA在豬生長發育調控方面的研究

circRNA參與了豬腦部、染色體、繁殖器官、肝臟、心肌、骨骼肌和肌肉等組織器官的生長發育。主要以吸附miRNA或參與各種組織器官有關生長發育的網絡構建來起到影響作用。

4.1 circRNA在腦部表達方面的研究

Veno等[35]做了大型動物大腦發育中第一個circRNA報告，共挖取了4634個circRNAs。他們發現在胚胎時期第60 d circRNA的表達量顯著高于第80 d時的表達量，且具有顯著的時空表達特征。陳建寧等人[36]發現，豬腦組織ceRNA共表達網絡中包含54個與年齡相關的circRNA。說明這些circRNA在豬胚胎大腦發育的生物學過程中發揮著重要調控功能。

4.2 circRNA在染色體方面的研究

李巧偉等人[37]在長白豬、通城豬和五指山豬16個發育階段和9種不同組織上共鑒定了8486條circRNAs。通過對circRNA的系統鑒定與分析，發現91%的circRNA屬于外顯子型，5%的circRNA屬于內含子型，僅4%的circRNA屬于基因間型。這些circRNA主要分布在1、6和13號染色體，平均長度為350 nt。馬繼登等[38]對豬背最長肌和腰大肌進行轉錄組測序后表明，在6個測序文庫中共鑒定出56個circRNAs。其中30個（57.57%）來源于未整合到染色體上的豬Scaffold序列，6個（10.71%）來源于豬13號染色體，14個 （25.00%）來源于豬14號染色體，3個（5.36%）來源于豬15號染色體，2個（3.57%）來源于豬18號染色體，1個（1.79%）來源于豬X染色體。

4.3 circRNA在繁殖器官方面的研究

王月鶯等[39]以大白豬的初產母豬為研究對象，在大白豬子宮內膜中得到了28055個circRNAs。篩選得到差異的circRNA富集的生物學功能主要是參與粘附、鈣離子通道活性和免疫調控等。郭天亞等[40-41]以豬卵巢卵泡和卵泡顆粒細胞為研究對象，經過分析發現，circRNA通過miRNA在轉錄后調控基因表達中起作用且在豬卵巢卵泡閉鎖過程中特異性表達并具有潛在的生物學功能。在豬顆粒細胞中,circINHA通過競爭性結合miR-10a-5p，上調CTGF表達來抑制顆粒細胞的凋亡。Cao等[42]在幾個物種的卵丘細胞和卵母細胞中鑒定了637個circRNAs。他們發現通過微量注射siRNA將母體circARMC4基因敲除會導致染色體排列嚴重受損，并顯著抑制第一極體的擠出和早期胚胎的發育。這些結果首次表明，circRNA在卵丘細胞和卵母細胞中以發育階段特異的方式大量動態表達，并且母系表達的circARMC4對豬卵母細胞減數分裂成熟和早期胚胎發育至關重要。謝蘇等人[43-45]先后鑒定了梅山豬及杜洛克豬circ0015292、circ0001651和circ0010513在卵泡中的表達研究。發現這三個circRNA通過靶標基因參與細胞周期、細胞增殖凋亡及卵巢發育等相關信號通路,提示其可能通過對靶基因的調控作用間接參與卵泡發育過程。

4.4 circRNA在肝臟方面的研究

鞏慧穎等[46]在二花臉豬和大白豬肝臟差異性circRNA功能預測分析試驗中發現,豬肝臟膽固醇代謝相關基因的差異表達可能與circRNA的調控有關。他們還發現，circRNA-ETFA吸附miRNA從而減弱miRNA對HMGCR的靶向抑制作用，添加HMB后,顯著增加了肝臟中HMGCR的蛋白表達及膽固醇的含量。陳建寧等人[36]發現，豬肝臟組織ceRNA共表達網絡中包含13個與年齡相關的circRNA。靳藝等[47]以陸川豬和杜洛克豬的肝臟、脂肪和肌肉組織樣品進行mRNA和circRNA的測序和分析發現，在陸川豬和杜洛克豬肝臟組織中篩選出1714個差異表達基因和190個差異表達circRNAs。

4.5 circRNA在心肌和骨骼肌方面的研究

陳建寧等人[36]發現豬心肌組織ceRNA共表達網絡中包含4個與年齡相關的circRNAs。豬骨骼肌組織ceRNA共表達網絡中包含17個與年齡相關的circRNAs。Chen[48]在心肌和骨骼肌衰老差異表達試驗中發現，心肌衰老過程中有26個circRNAs差異表達,骨骼肌衰老過程中有62個circRNAs差異表達，且心肌和骨骼肌的衰老過程有著根本的不同。之后他們構建了肌肉衰老過程中circRNA-miRNA-mRNA共表達網絡。Jing等[49]對淮南豬和杜洛克相互比較中發現，有66個差異顯著的circRNAs。其參與MYOD1、PPARD、miR-423-5p和miR-874這些與骨骼肌肉增殖、分化/再生和脂肪增生有關的網絡構建。曹海港等[50]以豬背最長肌和比目魚肌為研究材料，通過比對分析鑒定出26015和25130個circRNAs，其中10388個在兩種肌肉中共表達。進一步研究后篩選出調控豬肌纖維類型的關鍵circRNA，發現并驗證了circMYLK4能促進豬慢肌纖維的發育和抑制豬骨骼肌衛星細胞的分化功能。

4.6 circRNA在肌肉方面的研究

靳藝等[47]在肌肉組織中篩選出1367個差異表達基因和258個差異表達circRNAs。在脂肪組織中篩選出2173個差異表達基因和110個差異表達circRNAs。李媛等[51]對大白豬和萊蕪豬肌內脂肪組織中 circRNA的表達進行鑒定發現，sscirc002807、sscirc009352靶基因富集于膽固醇平衡和磷脂平衡等與脂代謝相關的生物學過程中。

5 展望

環狀RNA作為新一代研究方向的“明星”已經從諸多不同物種和組織中鑒定出來，但是它們在生物學過程中的調節功能各不相同。它們已顯然不是那個被認為是非正常剪接出來的副產物了，其在生物發展以及調控功能上的貢獻不容小覷。

目前，眾多研究學者對環狀RNA的未知功能進行了大量的相關試驗研究并發表了文章。彌補了人們對環狀RNA的不了解性，激發了人們對環狀RNA的研究興趣，引起了探索環狀RNA的熱潮。但這股潮流起步相對較晚，研究時間短，所以對環狀RNA的研究并不鞭辟向里。研究者還需要對待定物種進行基因組測序，提高轉錄組數據分析水平以及采用試驗手段找到和鑒定更多的circRNA并探究其發揮功能的分子機制，進一步挖掘其與經濟性狀相關的生物學功能和調控機制，為家畜育種提供理論依據。