動物細胞在疾病治療和診斷中的應用

李曉奇，王鳳武，韓健健

（1.內蒙古自治區農牧業科學院，內蒙古 呼和浩特 010021；2.通遼市動物疫病預防控制中心，內蒙古 通遼 028000）

動物細胞擁有大量的傳感和調節蛋白，用于維持細胞內部狀態的穩定。其中，跨膜受體蛋白持續監測細胞外環境，將特定的細胞外信號轉導為細胞內反應。配體蛋白與其同源受體的結合觸發細胞內信號級聯反應，最終誘導轉錄變化。研究人員一直在利用動物細胞的傳感蛋白及其生物合成能力構建回路，用于基于細胞的診斷和治療方式上。動物細胞常用作回路改造的載體，以創建能夠直接與人類疾病信號相關的細胞模型。

大多數可編輯的調控回路均源于轉錄因子 (TFs)調節的網絡。早期動物細胞回路主要由來自細菌或酵母（例如TetR或GAL4）的TFs與轉錄激活或抑制域（例如VP16或KRAB）融合而成。然而，近年來內源性TFs，如活化 T細胞的核因子(NFAT)、cAMP反應元件結合(CREB)、活化B細胞的核因子kappa-輕鏈增強子(NF-kB)以及信號激活劑轉錄(STAT)由上游天然或嵌合受體及其信號級聯激活，已被廣泛用于調控回路的條件表達。此外，可編程DNA結合域成為技術發展的重點領域，例如成簇的規則間隔短回文重復序列(Crispr)/Cas系統[1]。這些都極大地促進了針對內源性基因調控的編輯回路的研究。

1 動物細胞可溶性分子的傳感響應回路的研究進展

構建感知和響應病理水平可溶性回路的最簡單的方法是使天然配體與受體相互作用并重新連接相應的信號級聯以執行特定的響應。例如，分別過表達組胺HRH2受體或膽汁酸TGR5受體已被用于改造動物細胞以感知與過敏相關的組胺水平或與肝功能受損相關的高水平膽汁酸[2,3]。這兩種過表達受體都使用cAMP信號通路，該通路被重新連接以激活所需的轉錄輸出。此外，離子通道也被探索作為介質為細胞提供新的感覺功能。例如，過度表達電壓門控鈣通道的HEK細胞可以觸發天然鈣信號和NFAT轉錄因子的激活，以響應高葡萄糖水平；使用NFAT響應啟動子，可以獲得高血糖誘導的轉基因表達[4]。

另一類編輯傳感器和響應回路依賴于蛋白酶的信號轉導模塊。所謂的Tango受體系由天然受體組成，這些受體通過含有蛋白酶切割位點的柔性接頭在細胞內與合成TF（例如tTA）融合[5]。配體與其受體的結合會募集一種與目標蛋白酶融合的信號蛋白，該蛋白可從膜上切割并釋放 TF，使其進入細胞核并激活目的基因的表達。對不同的G蛋白偶聯受體 （GPCR）、受體酪氨酸激酶 (RTK)和類固醇激素受體，已使用Tango方法激活轉基因表達[5]。

任何已知的天然受體都無法精準識別眾多可作為診斷或治療目的的有價值的分子。為了拓展編輯細胞可以感知的分子庫，合成受體已在細胞外與選自噬菌體展示文庫的抗體單鏈可變片段(scFvs)融合，以靶向基于小分子或基于蛋白質的抗原。這種方法已在模塊化細胞外傳感器架構(MESA)載體中采用，該載體使用針對血管表皮生長因子的 scFv[6,7]。作為Tango樣受體，MESA受體基于將TF隔離在質膜上的前提下，在被可溶性配體激活后，蛋白水解釋放。但是，與Tango受體不同，MESA受體依賴于配體誘導的受體鏈二聚化：一條鏈通過蛋白酶切割位點與 TF融合，另一條鏈與適當的蛋白酶融合。有研究證明了MESA受體可以通過使用與轉錄激活域融合的催化死亡Cas9蛋白(dCas9)來調節內源基因表達(dCas9-TF)。配體結合觸發dCas9-TF的釋放，然后與靶向IL2基因座的單導RNA(sgRNA)結合以驅動細胞因子的表達[8]。然而，MESA方法有顯著的缺點：到目前為止，MESA系統在沒有配體的情況下顯示出明顯的活性，并可在配體結合后對基因表達進行適度的折疊誘導，從而導致出現假陽性的診斷結果。

最近，將Tango架構與dCas9轉錄因子相結合的工作在被優化后得到了更好的性能。基普尼斯等人設計將dCas9嵌合受體用于8種天然或進化的GPCR，可感應多種配體，包括合成小分子、激素、有絲分裂原、趨化因子和脂肪酸。將蛋白酶與GPCR的C端融合，將dCas9-TF與受體激活后募集的信號分子融合的策略優于原始的Tango架構（TF與受體融合，蛋白酶與募集的蛋白質融合）。此外，優化了將蛋白酶與受體融合的接頭的長度和組成，以實現更好的開關活性。Baeumler等人[9]開發了一個類似的系統，系基于拆分dCas9的策略。為了在關閉狀態下實現較低的基礎表達和激活劑處理后的較高誘導，他們篩選了控制受體dCas9分裂部分融合表達的啟動子，并在受體和蛋白酶切割位點之間添加了該輸出信號。

基于Tango和基于MESA的方法沒有利用進化的天然信號級聯實現信號放大，這可能限制了它們的效率（每個激活受體僅釋放一個TF）。此外，它們的性能高度依賴正確選擇啟動子以調節不同組分之間的比例。最近報道的廣義細胞外分子傳感器(GEMS)避免了這些問題[10]。GEMS架構是基于促紅細胞生成素受體與不同的配體結合結構域的融合，以感知和響應廣泛的細胞外可溶性分子。重要的是，GEMS受體的細胞質域由特定的信號域組成，用于激活四個可能的內源性信號通路（JAK/STAT、ERK/MAPK、磷脂酶C和PI3K/AKT）來同時驅動目的基因的轉錄程序。GEMS面臨著涵蓋大范圍的非信號分子的挑戰，包括癌癥生物標志物前列腺特異性抗原(PSA)，并在配體介導的受體二聚化時實現基因表達的高倍數誘導率。重要的是，PSA傳感GEMS能夠對被診斷為前列腺癌的患者的血清樣本進行分類。由于GEMS可以輕松適應新的可溶性抗原，因此有望成為開發基于細胞的多種疾病的診斷或治療的有效工具。

2 動物細胞表面結合分子的傳感響應回路的研究進展

感知和響應結合到其他細胞表面的分子的合成受體最著名的例子是所謂的嵌合抗原受體(CAR)。它們是臨床上最先進的工程T細胞，是細胞融合支持新療法的一個例子[11]。CARs包含細胞外抗體衍生的scFv或納米抗體，針對腫瘤相關抗原和T細胞受體復合物的細胞內調節域。表達CAR的T細胞能夠檢測并攻擊帶有靶抗原的癌細胞。

盡管在細胞因子釋放增加和對非癌細胞的攻擊方面仍然存在安全問題，但是，以B細胞特異性抗原CD19為靶點的CAR的臨床結果顯示出治療淋巴瘤的顯著療效[12]。為了更嚴格地控制這種療法，已經提出了幾種編輯策略[13,14]，包括與另一類受體的組合，這些受體依賴于Notch受體 (synNotch)的蛋白水解核心[15]。SynNotch受體由細胞外和細胞內結構域組成，能夠對輸入和輸出進行編程。與天然Notch信號傳導一樣，SynNotch受體通過與鄰近細胞中表面結合的抗原結合而被激活，觸發合成TFs的蛋白水解釋放，然后可以調節目標基因的表達。這些嵌合受體被設計用來感知來自免疫抑制性腫瘤微環境的抗原，并通過表達免疫刺激分子來做出反應。重要的是，SynNotch和CAR受體可通過結合來限制T細胞的激活，因此它僅在攜帶兩種靶抗原的腫瘤細胞出現時被激活。

作為靶向細胞結合抗原分子的一種方法，HEK細胞最近被設計成細胞間接觸信號通路，能夠識別癌細胞并在與靶細胞結合后釋放殺傷酶[16]。JAK-STAT信號由IL4和IL13受體部分的異二聚化介導，被用作載體來構建合成的細胞特異性接觸傳感裝置。IL4和IL13受體的細胞外結構域可與針對乳腺癌標志物人表皮生長因子受體2(HER2)的scFv融合。此外，磷酸酶CD45胞內結構域被用作JAK-STAT信號傳導的有效阻斷劑。殺傷細胞與靶細胞的結合消除了這種抑制，其通過STAT6誘導信號傳導，并從合成的STAT6響應啟動子中表達所選基因。為了進行概念驗證，使用與細胞穿透肽融合的前體切割酶開展轉錄輸出。回路轉導的HEK殺傷細胞可以區分表達HER2的HEK細胞并提供殺傷程序。重要的是，該殺死模塊可移植到臨床使用的人類間充質干細胞中，這可以殺死攜帶HER2的SKBR3乳腺癌細胞。

綜上所述，這里描述的編輯受體庫允許細胞進行高度復雜的編程，以響應人體內的多種生化信號，并根據相鄰細胞和環境做出決定。

3 動物細胞作為診斷工具的研究進展

關于使用編輯細胞進行診斷的研究，無論是通過將細胞暴露于人類臨床樣本進行體外診斷，還是通過將細胞植入體內進行體內診斷，設計的回路必須包含具有易于測量的輸出的報告模塊。

為了彌補目前過敏診斷方法的缺陷，包括重現性差和與臨床癥狀的相關性差等，研究人員基于組胺傳感裝置開發了一種受體外診斷方法[2]。組胺通過結合和激活組胺GPCR(HRH1-4)來介導過敏癥狀。HEK細胞被設計用于其中一種受體(HRH2)的異位表達，并且相應的cAMP信號通路被重新連接以通過合成的cAMP響應啟動子驅動報告基因表達。將人類全血樣本暴露于過敏原會觸發免疫效應細胞（如嗜堿性粒細胞）釋放組胺，從而在體外模擬患者體內特定的過敏反應。當編輯細胞暴露于用不同濃度過敏原處理的人體血液樣本時，他們可以根據暴露水平對樣品進行檢測。

相關研究也在體內診斷方面取得了長足的進步，可以加快實現對病理狀況的近實時監測。有研究人員創建了一種新的體內診斷策略，該策略借由植入的工程細胞來實現，當檢測到血液中疾病生物標志物水平的變化時，這些細胞會產生皮膚紋身[17]。編輯細胞可持續監測血鈣并產生黑色素以響應持續的輕度高鈣血癥，并在移植了這些細胞的患者的皮膚上產生可見的黑色標記。這種診斷性紋身的設計是通過將異位表達的鈣受體CaSR的信號級聯重新連接到嵌合啟動子，從而觸發酪氨酸酶的Ca2+響應性表達，最終產生黑色皮膚色素黑色素。作為概念驗證，生物醫學紋身系通過對接種乳腺癌或結腸癌細胞的小鼠的持續性的與癌癥相關的高鈣血癥反應，有效地診斷出小鼠的無癥狀結腸癌和乳腺癌。在一個更接近人的模型中，微囊化紋身工程細胞被放置在豬的皮膚下，并在血鈣水平升高的動物皮膚中形成基于黑色素的黑色紋身。在具有已知風險因素的患者體內植入這種用于檢測前早期癌癥的診斷工具可以增加治療的選擇性和存活率。

雖然過敏診斷方法系基于感知組胺，但IL-4和IL-13細胞因子也可用作信號輸入，以開發過敏細胞療法[18]。當免疫系統暴露于特定的過敏原時，Th2細胞會釋放大量的細胞因子。此外，中和過敏患者血液中的IgE抗體已被證明可以減輕癥狀。因此，設計了一種合成裝置來檢測IL-4或IL-13的存在，并觸發能夠結合并滅活IgE抗體的設計錨蛋白重復蛋白（DARPinE279）的產生。

4 結論與展望

編輯動物細胞具有從根本上改變診斷、預防和治療方法的潛力。正如我們上面所討論的，已經提出了幾種策略來提高工程化T細胞的功效和安全性。此外，最近克服了僅針對腫瘤細胞表面結合抗原的嚴格限制，從而可以將CART細胞療法擴展到可溶性抗原，在結合后誘導受體二聚化。

與此同時，隨著基因編輯研究手段的多樣化，將為應對隨著臨床實驗增加而不可避免地出現的新挑戰提供空間。例如，截至今天仍然缺乏具有快速響應特性的合成回路，故難以使患有糖尿病等疾病的患者受益。為了實現幾分鐘的響應時間這一目標，其回路必須繞過基于轉錄的緩慢響應，而依賴于轉錄后事件。