I 型干擾素誘導(dǎo)表達的三基序蛋白22 引發(fā)線粒體交聯(lián)促進心肌細胞凋亡

宋雙，孫大康，崔明麗，王倩倩，趙希軍，徐會圃，李洋，程艷麗

心肌炎是指心肌存在炎癥浸潤，并伴有鄰近心肌細胞退行性和（或）壞死性改變，而不是典型的心肌梗死相關(guān)的缺血性損傷[1]。心肌炎通常由感染引起，最常見于柯薩奇病毒B3 等病毒感染，其臨床表現(xiàn)差異大，可出現(xiàn)心力衰竭、心臟驟停等嚴重并發(fā)癥[2-3]。柯薩奇病毒B3 感染機體后，會誘導(dǎo)心肌細胞高度表達I 型干擾素（IFN，包括IFN-α、IFN-β 等），通過多種方式增強免疫系統(tǒng)應(yīng)答，抑制病毒感染。另一方面，過度激活的免疫系統(tǒng)可產(chǎn)生大量的細胞因子，IFN 等細胞因子可促進心臟的炎性浸潤，加重心肌損傷[4]。

三基序蛋白（TRIM）家族因高度保守的RBCC 結(jié)構(gòu)得名，該結(jié)構(gòu)包括Ring、B-Box 和Coiled-coil 3個部分。TRIM 家族對細胞凋亡、轉(zhuǎn)錄、分化及抗病毒感染等都具有重要的生物學(xué)作用。TRIM 家族中TRIM5α、TRIM19 和TRIM22 等均具有抗病毒活性，其中TRIM5α 可限制人類免疫缺陷病毒復(fù)制，TRIM19 在抗人類巨細胞病毒感染過程中發(fā)揮重要作用[5]。TRIM22 可針對各種病毒蛋白，其中以逆轉(zhuǎn)錄病毒多見[6]。目前已證實TRIM22 在人類免疫缺陷病毒、腦心肌炎病毒、乙肝病毒感染中發(fā)揮重要作用[7-8]。在神經(jīng)元細胞模擬缺血/低氧刺激模型中，TRIM22表達上調(diào)并促進核因子κB（NF-κB）的激活，使炎性因子如腫瘤壞死因子α（TNF-α）、白細胞介素6（IL-6）釋放明顯增多，促進神經(jīng)元細胞凋亡[9]。

研究表明IFN 可誘導(dǎo)TRIM22 在T 淋巴細胞和單核細胞來源的巨噬細胞中表達上調(diào)。研究還發(fā)現(xiàn)，過表達TRIM22 可顯著誘導(dǎo)人巨噬細胞系U937 產(chǎn)生促炎細胞因子，加重細胞免疫造成的組織損傷[7]。有意思的是，Chen 等[10]發(fā)現(xiàn)TRIM22 可誘導(dǎo)促凋亡蛋白Bak 的表達增加和寡聚化，并通過天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶依賴途徑促進單核細胞凋亡。因此推測：在病毒性心肌炎中，IFN 過表達會誘導(dǎo)心肌細胞高表達TRIM22，進而影響心肌細胞的凋亡進程。

1 材料與方法

1.1 材料

MZ-0972 人心肌細胞（HCM）細胞株購自中國寧波明舟生物科技有限公司；DMEM 高糖培養(yǎng)基、磷酸鹽緩沖液（PBS）購自美國Hyclone 公司；胎牛血清購自中國四季青公司；胰蛋白酶溶液購自中國索萊寶公司；重組人IFN-α2b 注射劑（以下簡稱IFN-α，中國北京凱因科技股份有限公司，批號：S20030030）；RNAiso Plus、PrimeScript?Ⅳ1st strand cDNA Synthesis Mix、TB Green?Premix Ex Ta q?Ⅱ（試劑）購自日本TaKaRa 公司；5' Flag-pcDNA3.1-TRIM22質(zhì)粒、5' Flag-pcDNA3.1 空質(zhì)粒為濱州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院臨床醫(yī)學(xué)實驗中心保存；Opti-MEM 無血清培養(yǎng)基、LipofectamineTM3000、P3000TM（試劑）購自美國Invitrogen 公司；Annexin V-PE/7-AAD 細胞凋亡檢測試劑購自美國BD Pharmingen 公司；MitoTracker-Deep Red（試劑）購自美國Life technologies 公司；FLAG鼠源性單抗（F3165，試劑）購自美國Sigma 公司；Rabbit anti-TRIM22 polyclonal antibody（HPA003307，試劑）購自美國Sigma 公司；抗人actin 兔源多抗（試劑）購自美國Cell Signaling Technology 公司；辣根過氧化物酶（HRP）標記anti-mouse IgG（6170-05，試劑）、HRP 標記anti-rabbit IgG（4030-05，試劑）購自美國SouthernBiotech 公司；ECL Plus Western Blotting Substrate（試劑）購自美國Thermo 公司。

1.2 方法

細胞培養(yǎng)、IFN-α 刺激及實驗分組：HCM 以含有10 %胎牛血清的DMEM 高糖培養(yǎng)基培養(yǎng)，置于37 ℃、5%二氧化碳、飽和濕度的溫箱中培養(yǎng)，待細胞生長融合至80 %進行傳代實驗（多選取第3-6代）。

（1）觀察IFN-α 對HCM 凋亡的影響（流式細胞術(shù)）：將傳代細胞按5×105/孔密度接種至12 孔板，培養(yǎng)12 h 后用不同濃度（0、500、2 000、8 000 U/ml）的IFN-α 刺激HCM，即分為IFN-α 0 U/ml組、IFN-α 500 U/ml 組、IFN-α 2 000 U/ml 組、IFN-α 8 000 U/ml 組（其中IFN-α 0 U/ml 組為空白對照組，不添加干擾素），繼續(xù)培養(yǎng)48 h，收集細胞備用（n=3）。（2）檢測IFN-α 與TRIM22 表達的時間依賴性[實時熒光定量PCR（realtime PCR）]：將傳代細胞按3×106/孔密度接種于5 個6 cm 培養(yǎng)皿中，按時間點（0、6、12、18、24 h），依次加入2 000 U/ml IFN-α，即分為IFN-α 0 h 組、IFN-α 6 h 組、IFN-α 12 h 組、IFN-α 18 h 組、IFN-α 24 h 組（其中IFN-α 0 h 組為空白對照組），收集細胞備用（n=9）。③檢測 IFN-α 與TRIM22 表達的劑量依賴性[realtimePCR、蛋白免疫印跡（Western blot）檢測]：將傳代細胞按3×106/孔密度接種于4 個6 cm 培養(yǎng)皿中，用不同濃度的 IFN-α 刺激HCM，分組同前所述，繼續(xù)培養(yǎng)12 h，收集細胞備用（PCR 實驗組n=9；Western blot 實驗組n=3）。

realtime PCR 檢測：取1 ml Trizol 提取細胞總RNA，逆轉(zhuǎn)錄成互補DNA 作為模板，再通過PCR儀檢測TRIM22 mRNA 的相對表達量，以未刺激組作為對照。具體步驟嚴格按照試劑盒說明書進行。TRIM22 上游引物5'-CAAACATTCCGCATAAAC-3'，下游引物 5'-CACATTCACCTCGCCTTC-3'；管家基因上游引物5'-AACGGATTTGGTCGTATTG3'，下游引物 5'-GCTCCTGGAAGATGGTGAT-3'，預(yù) 期TRIM22擴增片段大小為240 bp。將模板95 ℃變性30 s，再按以下參數(shù)反應(yīng)40 個循環(huán)：95 ℃變性5 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s。以甘油醛-3-磷酸脫氫酶為內(nèi)參，采用2-??Ct方法分析TRIM22 mRNA 的表達水平。

轉(zhuǎn)染：在轉(zhuǎn)染12 h 前，將HCM 接種至12 孔板中。在細胞匯合度約60 %～80 %時用Opti-MEM（100 μl/孔）稀釋Lipofectamine 3000TM；然后以O(shè)pti-MEM（100 μl/孔）稀釋對應(yīng)質(zhì)粒，并加入P3000TM充分混勻；將稀釋后的兩者混勻，室溫孵育15 min。將上述混合物加入細胞中，輕輕晃動混勻，37 ℃繼續(xù)培養(yǎng)24 h（激光共聚焦）或48 h（流式細胞術(shù)）。

細胞裂解和Western blot 分析：將細胞用冷PBS漂洗一次，向每孔中（12 孔板）加入150 μl Laemmli上樣緩沖液，裂解后的蛋白樣品收集入1.5 ml Ep 管，沸水浴5 min。每個蛋白樣品上樣10 μl 于10 % SDS-聚丙烯酰胺凝膠，經(jīng)電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉后，分別加入對應(yīng)的一抗，在室溫條件下?lián)u床孵育1 h。用TBST漂洗硝酸纖維素膜3 次，每次5 min。加入HRP 標記的對應(yīng)二抗，室溫搖床孵育1 h。洗膜。將適量等體積的增強化學(xué)發(fā)光顯色液A 液和B 液混合，覆蓋硝酸纖維素膜1～2 min，在暗室中進行曝光成像。

流式細胞術(shù)：轉(zhuǎn)染質(zhì)粒后48 h 收集細胞，預(yù)冷的PBS 漂洗，100 μl 1×結(jié)合緩沖液重懸細胞，轉(zhuǎn)移至Falcon 流式管（BD）中，分別加入5 μl 膜聯(lián)蛋白V-藻紅蛋白（Annexin V-PE）和5 μl 7-氨基放線菌素D（7-AAD）溶液，混勻后室溫下避光孵育15 min。最后加入400 μl 結(jié)合緩沖液混勻。用FACS Calibur 流式細胞儀檢測HCM 凋亡情況。

激光共聚焦：pEGFP-N3-TRIM22 載體轉(zhuǎn)染HCM 24 h 后，加入37 ℃預(yù)熱的MitoTracker-Deep Red 染色工作液，終濃度為100 nmol/L，37 ℃繼續(xù)培養(yǎng)30 min。再加入1 ml PBS，以備觀察。部分細胞 以pEGFP-N3-TRIM22 載體轉(zhuǎn)染HCM 24 h 后，PBS 漂洗1 次，4%多聚甲醛固定15 min。用PBS漂洗2 次，加入含0.2 % Triton X-100 的PBS 通透10 min。PBS 漂洗2 次，加入4'，6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）染液1 ml（1 μg/ml），室溫避光染色10 min。PBS 漂洗2 次，再加入1 ml PBS，以備觀察。激光共聚焦顯微鏡（Leica TCS SP5，德國）選用63 倍物鏡（油鏡，數(shù)值孔徑1.4），MitoTracker-Deep Red 激發(fā)波長為644 nm，綠色熒光蛋白（GFP）激發(fā)波長為488 nm。通過ImageJ 1.50i 軟件JACoP 插件分析。

統(tǒng)計學(xué)分析方法：采用SPSS 26.0 軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析，定量資料用均數(shù)±標準差（）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間差異采用獨立樣本t檢驗分析。每組實驗均重復(fù)3 次，每次采用3 復(fù)孔。P<0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 IFN-α 誘導(dǎo)HCM 凋亡（圖1）

流式細胞術(shù)檢測不同劑量IFN-α 刺激HCM后細胞凋亡情況。結(jié)果顯示，IFN-α 0 U/ml 組、IFN-α 500 U/ml 組、IFN-α 2 000 U/ml 組、IFN-α 8 000 U/ml 組的細胞凋亡率（AnnexinV-PE+細胞所占比率）分別為6.10 %、20.90 %、25.69 %、30.37%（圖1A）。經(jīng)統(tǒng)計學(xué)分析顯示，與IFN-α 0 U/ml 組相比，IFN-α 刺激各組細胞凋亡率顯著升高（P<0.05），且IFN-α 誘發(fā)的HCM 凋亡率呈劑量依賴性（P均<0.05，圖1B）。

圖1 IFN-α 呈劑量依賴性誘導(dǎo)人心肌細胞凋亡

2.2 IFN-α 促進HCM 中TRIM22 的表達（圖2）

IFN-α 刺 激HCM，經(jīng)realtime PCR 法檢測TRIM22 mRNA 表達水平。時間梯度組realtime PCR結(jié)果：IFN-α 0 h 組為1.02±0.18，IFN-α 6 h 組為537.74±66.94，IFN-α 12 h 組 為863.30±19.68，IFN-α 18 h 組為194.34±61.07，IFN-α 24 h 組為138.56±26.31；經(jīng)統(tǒng)計學(xué)分析顯示，以2 000 U/ml IFN-α 刺激HCM 6 h 后TRIM22 mRNA 表達顯著上調(diào)，12 h 達最高，隨后逐漸下降（P<0.05，圖2A）。濃度梯度組realtime PCR 結(jié)果：IFN-α 0 U/ml 組為1.04±0.28，IFN-α 500 U/ml 組 為257.72±23.55，IFN-α 2 000 U/ml 組為368.09±10.37，IFN-α 8 000 U/ml 組為1 451.36±214.39；經(jīng)統(tǒng)計學(xué)分析顯示，刺激時間一定（12 h），與IFN-α 0 U/ml組之間相比，IFN-α 500 U/ml 組、IFN-α 2 000 U/ml 組、IFN-α 8 000 U/ml 組TRIM22 mRNA 表達水平呈逐漸升高的趨勢（P<0.05，圖2B），存在劑量依賴性。Western blot 檢測結(jié)果：IFN-α 0 U/ml 組 為0.00，IFN-α 500 U/ml 組 為1.00，IFN-α 2 000 U/ml 組為1.28±0.06，IFN-α 8 000 U/ml 組為2.86±0.12；經(jīng)統(tǒng)計學(xué)分析顯示，三種濃度的IFN-α 均可顯著促進HCM 中TRIM22 分子蛋白的表達（P<0.05，圖2D）。

圖2 IFN-α 誘導(dǎo)人心肌細胞中TRIM22 表達上調(diào)

2.3 過表達TRIM22 促進HCM 凋亡

2.3.1 過表達TRIM22 上調(diào)HCM 凋亡率（圖3）

將5' Flag-TRIM22-pcDNA3.1 質(zhì)粒（TRIM22 組）或5' Flag-pcDNA3.1 空質(zhì)粒（空載體組）分別轉(zhuǎn)染HCM，流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡情況。結(jié)果顯示，TRIM22 組細胞凋亡率（AnnexinV-PE+細胞比率）為14.72 %，空載體組細胞凋亡率為6.02 %（圖3A）;TRIM22 組細胞凋亡率（14.64±0.26）%，空載體組細胞凋亡率（5.89±0.18）%（圖3B）。Western Blot結(jié)果顯示TRIM22 組（1.00±0.22）%。經(jīng)統(tǒng)計學(xué)分析，TRIM22 組細胞凋亡率與空載體組相比（圖3B），兩組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）；Western blot 檢測發(fā)現(xiàn)TRIM22 組TRIM22 蛋白表達顯著升高（圖3C、3D），提示過表達TRIM22 能促進HCM 凋亡。

圖3 TRIM22 在人心肌細胞中過表達對細胞凋亡的影響

2.3.2 過表達TRIM22誘發(fā)HCM凋亡小體的產(chǎn)生（圖4）

將HCM 分為TRIM22-增強綠色熒光蛋白（Enhanced Green Fluorescent Protein,EGFP）轉(zhuǎn)染組和空載體組，用MitoTracker-Deep Red 對線粒體染色。激光共聚焦檢測發(fā)現(xiàn)，空載體組細胞形態(tài)舒展，呈現(xiàn)為短柱狀或單端為梭形。線粒體多以長管網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，散在分布于HCM 中（圖4A）。在TRIM22-EGFP 轉(zhuǎn)染組，TRIM22-EGFP 團塊散在分布，可誘發(fā)HCM 出現(xiàn)凋亡小體（黑色箭頭），呈現(xiàn)典型的細胞晚期凋亡特征；同時，凋亡細胞的線粒體多呈現(xiàn)為短棒狀、圓球狀（圖4B）。上述結(jié)果說明，與空白對照組相比TRIM22 高表達不僅可以促進凋亡小體的出現(xiàn)，還可引起線粒體出現(xiàn)明顯的片段化（線粒體分裂作用增強）。

圖4 過表達TRIM22 誘發(fā)人心肌細胞中凋亡小體的產(chǎn)生（比例尺：10 μm）

2.4 激光共聚焦觀察TRIM22 與線粒體的共定位情況及對線粒體的影響

2.4.1 TRIM22 在HCM 中的亞細胞定位（圖5）

真核表達載體pEGFP-N3-TRIM22 轉(zhuǎn)染HCM 24 h 后，激光共聚焦檢測發(fā)現(xiàn)：在胞漿區(qū)（白色箭頭）和胞核區(qū)（黑色箭頭）有大量TRIM22-EGFP 綠色熒光蛋白分布（圖5），且多呈聚合體團塊狀。

圖5 三基序蛋白22 在人心肌細胞中的亞細胞定位（比例尺：10μm）

2.4.2 TRIM22 與線粒體的共定位及線粒體交聯(lián)作用（圖6）

將pEGFP-N3-TRIM22 轉(zhuǎn) 染HCM，通 過MitoTracker-Deep Red 染色，激光共聚焦檢測發(fā)現(xiàn)TRIM22-EGFP 在HCM 中，以大小不等的綠色團塊分布，線粒體則為紅色點塊狀或條索狀；TRIM22-EGFP 綠色熒光蛋白與兩個紅色線粒體存在共定位，呈現(xiàn)為黃色團塊（圖6A 白色箭頭所示）。

圖6 TRIM22 與線粒體的共定位及交聯(lián)作用

本研究還發(fā)現(xiàn)在空載體組中，線粒體多以長管網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)存在（圖6B-1 白色箭頭所示）；在TRIM22-EGFP 轉(zhuǎn)染組（圖6B-2）中，線粒體多以片段化形態(tài)存在，呈現(xiàn)為短棒狀、圓球狀。提示TRIM22 可影響線粒體的融合、分裂過程。由于TRIM22-EGFP 團塊的面積大于共定位線粒體（接觸部位）的面積，提示TRIM22 蛋白可能僅有少量進入線粒體，大部分滯留于胞漿，發(fā)揮線粒體交聯(lián)作用。經(jīng)ImageJ 1.50i軟件JACoP 插件分析，在圖6B-2 白色箭頭選定區(qū)域中TRIM22-EGFP 與線粒體的Manders 重疊系數(shù)為0.71（參考范圍：0～1），提示當(dāng)TRIM22 在HCM中大量表達時，可導(dǎo)致大范圍的線粒體交聯(lián)。上述結(jié)果表明在HCM 中TRIM22 與線粒體存在共定位，TRIM22 過表達會影響線粒體融合和分裂過程，造成線粒體動力學(xué)失衡。

3 討論

心肌炎可由感染性病原體、藥物和毒素引起,其中病毒感染已被證實為心肌炎最常見的原因[11]。目前認為病毒性心肌炎的發(fā)病機制包括病毒介導(dǎo)的直接損傷以及宿主免疫反應(yīng)引起的間接損傷[12]。Ammirati 等[13]指出，病毒可以觸發(fā)免疫反應(yīng)發(fā)揮保護機體的作用，但不均衡的免疫反應(yīng)可能會導(dǎo)致心肌損傷。研究證實心肌炎患者中I 型IFN、IL-6、TNF-α 等細胞因子表達水平顯著升高[14]。

大量實驗表明I 型IFN 不僅可誘發(fā)腫瘤細胞凋亡，亦可引起正常組織細胞凋亡。本實驗用IFN-α刺激HCM，流式細胞術(shù)檢測發(fā)現(xiàn)IFN-α 可誘導(dǎo)HCM 凋亡，且存在劑量依賴性。推測，在暴發(fā)性心肌炎發(fā)生時，過度表達的I 型IFN 可能會誘發(fā)心肌細胞凋亡，造成心肌細胞的直接損傷。Qaisar 等[15]發(fā)現(xiàn)，過度活化I 型IFN 信號通路可觸發(fā)針對胰腺細胞抗原的自身免疫性應(yīng)答，驅(qū)動胰島炎癥部位的細胞發(fā)生細胞凋亡。Herzer 等[16]研究發(fā)現(xiàn)IFN-α可通過早幼粒細胞白血病蛋白（PML）和腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體（TRAIL）蛋白介導(dǎo)誘發(fā)肝癌細胞凋亡。應(yīng)注意的是，I 型IFN 在宿主對病毒感染的防御中起關(guān)鍵作用，但必須在強度和持續(xù)時間上受到嚴格調(diào)控，以防止過度免疫反應(yīng)導(dǎo)致自身炎癥，加重心肌損傷[17]。阻斷IFN 調(diào)節(jié)因子3 依賴的信號通路會誘導(dǎo)心肌炎性因子表達減少，減輕心臟炎性細胞浸潤及心室擴張，進而改善心功能[18]。上述研究表明，IFN 對病毒感染存在雙重影響，既有利于清除有害病菌，又可加重心肌損傷。

TRIM22 在I 型IFN 致心肌細胞凋亡過程中發(fā)揮重要作用。I 型IFN 是一種廣譜抗病毒分子，在抗病毒固有免疫應(yīng)答中發(fā)揮重要作用[8]。研究發(fā)現(xiàn)，I 型IFN 可誘導(dǎo)單核細胞、淋巴細胞等高表達TRIM22[19]，同時Chen 等[10]報道過表達TRIM22 可加速單核細胞凋亡。推測，TRIM22 可能誘發(fā)心肌細胞凋亡。本實驗發(fā)現(xiàn)IFN-α 刺激HCM 6 h 后TRIM22 mRNA 表達顯著上調(diào)，12 h 達最高，隨后逐漸下降。同時IFN-α 誘導(dǎo)HCM 中TRIM22 mRNA高表達呈顯著的劑量依賴性。流式細胞術(shù)檢測發(fā)現(xiàn)，與空載體組相比，TRIM22 組心肌細胞凋亡率顯著增加。

線粒體融合、分裂過程被稱為線粒體動力學(xué)，是線粒體網(wǎng)絡(luò)形成的基礎(chǔ)，細胞進行有氧代謝有賴于線粒體網(wǎng)絡(luò)的形成[20]。線粒體經(jīng)不斷融合，便于受損線粒體的修復(fù)、線粒體膜電位的維持以及能量的產(chǎn)生。通過線粒體分裂，細胞可以把受損的線粒體清除出細胞，以維持線粒體的正常功能。本實驗經(jīng)激光共聚焦發(fā)現(xiàn)TRIM22 與線粒體存在共定位關(guān)系，并且TRIM22 可引發(fā)線粒體的廣泛交聯(lián)，影響線粒體的融合及分裂過程，導(dǎo)致線粒體動力學(xué)失衡。本研究發(fā)現(xiàn)TRIM22 過表達引發(fā)HCM 出現(xiàn)多個凋亡小體，呈現(xiàn)典型的細胞晚期凋亡特征；同時凋亡細胞的線粒體出現(xiàn)明顯的片段化，提示凋亡細胞的線粒體動力學(xué)失衡。線粒體受損后，釋放促凋亡因子P53、細胞色素C 等，破壞線粒體電子傳遞鏈，導(dǎo)致ATP 生成減少，細胞無法獲得充足的能量；同時線粒體膜電位下降，Ca2+內(nèi)流增加致細胞內(nèi)鈣超載，最終可導(dǎo)致細胞死亡[21]。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)IFN-α 可誘導(dǎo)HCM 高表達TRIM22，TRIM22 可引發(fā)線粒體交聯(lián)，影響線粒體的正常功能，誘導(dǎo)HCM 凋亡。

利益沖突：所有作者均聲明不存在利益沖突參考文獻

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