抗HIV藥物齊夫多定、拉夫米定和克力芝聯合用藥的急性經口毒性和致突變作用

葛憲民，李 彬，黃超培*，高玉秋，羅海蘭，楊 慧，王彥武，溫平鏡，藍光華，陳歡歡，孟 琴，羅柳紅，鄧月琴，劉帥鳳，吳秀玲

（廣西壯族自治區疾病預防控制中心，廣西 南寧 530028）

感染人類免疫缺陷病毒（human immunodeficiency virus，HIV）的育齡婦女可以在妊娠、分娩和哺乳階段將HIV傳播給嬰兒，這種母嬰傳播是導致我國近年15歲以下兒童感染HIV的主要原因。因此，采取有效措施阻斷HIV母嬰傳播（prevention of mother-to-child transmission，PMTCT）是控制HIV感染進一步擴散蔓延的關鍵。目前，以高效抗反轉錄病毒藥物聯合治療的干預措施，已經可使HIV母嬰垂直傳播率大幅降低，阻斷效果顯著；但在服藥過程中會出現一些藥物的不良反應，如消化系統癥狀、肝腎毒性、骨髓抑制、高脂血癥和皮疹等。為了評價抗HIV聯合用藥的安全性，本文對抗HIV PMTCT的常用聯合藥物方案進行急性毒性和遺傳毒性研究。

1 材料與方法

1.1 受試物及處理

選擇目前較常用的抗HIV PMTCT用藥方案的聯合藥物，齊夫多定（zivdodine，AZT）、拉米夫定（lamivudine，3TC）和克力芝（kaletra，LPV/r）作為研究對象，3種藥均為片劑，其中AZT規格為520 mg/片（批號為AM18029），3TC為618 mg/片（批號為AZ19011），兩者每片的有效成分含量均為300 mg，均為上海迪賽諾生物醫藥有限公司產品。LPV/r由德國AbbVie Deutschland GmbH&Co.KG公司生產，規格為1 250 mg/片（批號為1104498），每片含洛匹那韋200 mg和利托那韋50 mg。每日推薦孕產婦服用量為：AZT 2片+3TC 1片+LPV/r 2片，3種藥品的有效成分攝入量合計1 400 mg，按體質量60 kg計算，折合劑量為23.3 mg/kg。試驗前，按上述比例將3種藥片混在一起，粉碎成粉末（有效成分含量為33.67%），密封保存備用，臨用前用純水配成需要的濃度。

1.2 試驗動物與菌株

SPF級健康成年昆明種小鼠，由廣西醫科大學實驗動物中心繁殖，動物生產許可證號：SCXK（桂）2014-0002，合格證號：45000300000932/958。動物飼料由廣東省醫學實驗動物中心生產，許可證號：SCXK（粵）2013-0002。動物房為屏障系統，使用許可證號：SYXK（桂）2016-0002。動物實驗室溫度為22～25℃，相對濕度55%～70%。鼠傷寒沙門氏菌組氨酸缺陷型TA97a、TA98、TA100、TA102、TA1535共5種菌株均購于美國MOLTOX公司，貯存于4℃冰箱，使用前經生物特性鑒定符合試驗要求。

1.3 代謝活化系統及陽性物

肝微粒體酶S購自瑞德肝臟疾病研究（上海）有限公司，貯存于-70℃液氮中。陽性對照物2-氨基芴購自國藥集團化學試劑有限公司，敵克松購自德國Dr.Ehrenstorfer公司，柔毛霉素購自加拿大TRC。

1.4 試驗方法

1.4.1 急性經口毒性試驗

采用最大給藥量法，選體質量為18～22 g的昆明種成年小鼠20只，雌、雄性各10只，試驗前禁食16 h，不限飲水。用純水將聯合藥物混合配成有效成分濃度為250 mg/mL的混懸液，然后按0.02 mL/g給小鼠灌胃1次，劑量為5 000 mg/kg（有效成分），灌胃后觀察、記錄小鼠的中毒表現和死亡情況，觀察14 d。

1.4.2 細菌回復突變試驗

采用平板摻入法，設50、158、500、1 581、5 000μg/皿（有效成分）5個劑量組，同時設自發回變對照（不加受試物）、陰性對照（純水）和陽性突變劑對照。用純水將聯合藥物配成相應濃度的混懸液，經過高壓滅菌（0.103 MPa作用20 min）處理后供試驗用。將試驗菌株增菌液0.1 mL、受試溶液0.1 mL（需代謝活化者再加入10%S混合液0.5 mL）依次加入保溫的頂層培養基試管內，混勻后倒入底層培養基平板上，迅速均勻鋪開。每個劑量組的每種菌株設3個平行皿，在37℃恒溫培養48 h，計數每皿的回變菌落數并計算每組平均菌落數。當受試物回變菌落數超過自發回變菌落數的2倍并存在劑量-反應關系者為陽性結果。重復試驗1次。

1.4.3 哺乳動物體內微核試驗

采用30 h兩次給受試物法，間隔24 h。設3個劑量組，分別設為500、1 000、2 000 mg/kg（有效成分），1個陰性對照組（等體積的純水）和1個陽性對照組（2 mg/mL環磷酰胺溶液）。每組10只小鼠，雌、雄性各半。用純水將聯合藥物分別配成有效成分濃度為25、50、100 mg/mL的混懸液，按0.02 mL/g分別給予試驗組動物灌胃。第2次給受試物后20 h處死動物，取股骨骨髓用小牛血清稀釋涂片，經甲醇固定和Giemsa染色后在顯微鏡下觀察，每只動物計數2 000個嗜多染紅細胞（polychromatic erythrocyte，PCE），微核率以含微核的PCE千分率表示。同時每只小鼠觀察200個嗜多染紅細胞，計算嗜多染紅細胞與成熟紅細胞（normochromatic erythrocyte，NCE）的比值PCE/NCE。

1.4.4 哺乳動物精原細胞染色體畸變試驗

分組設計和處理同1.4.3。2 000 mg/kg劑量組10只雄性小鼠，其余組均為5只雄性小鼠，僅給藥1次。給予受試物后20 h，每組各取5只小鼠，按0.01 mL/g腹腔注射0.5 mg/mL的秋水仙素；給予受試物后44 h，以相同方法給2 000 mg/kg劑量組另5只動物注射秋水仙素。在注射秋水仙素4 h后，用頸椎脫臼法處死動物，取兩側睪丸。將睪丸放在1%檸檬酸三鈉中分離曲細精管，之后在甲醇/冰乙酸（3∶1，

V/V

）固定液中固定2次，在60%冰乙酸中軟化并打勻離心。將收集到的細胞混懸液滴于冰水冷卻的玻片上，制成2～3張片，經Giemsa染色后在光學顯微鏡下鏡檢。每只動物計數100個中期分裂相細胞，觀察精原細胞染色體數目和結構改變，記錄含染色體結構畸變的細胞數，統計各組不同類型的染色體結構畸變數目和頻率（染色體裂隙不計入畸變率）。

1.5 統計學方法

應用SPSS 17.0統計軟件，微核試驗中數據按Poisson分布的兩樣本均數比較法進行統計分析；染色體畸變試驗采用

χ

檢驗進行分析。

2 結果

2.1 急性經口毒性試驗

給予5 000 mg/kg的聯合藥物后，小鼠的飲食和活動正常，14 d觀察期間小鼠的體質量增長未受到明顯影響，未見中毒體征和死亡，試驗結束解剖小鼠，肉眼觀察主要器官組織未見異常病變，聯合藥物對小鼠的急性經口毒性LD大于5 000 mg/kg。

2.2 細菌回復突變試驗

在加和不加S代謝活化系統的兩種條件下，各試驗菌株陽性對照組的回變菌落數均遠超自發回變菌落數的2倍，試驗體系可靠。聯合藥物各劑量組5種試驗菌株的回變菌落數與自發回變菌落數及陰性對照組的回變菌落數接近，且不存在劑量-反應關系，見表1。重復試驗的結果也與其一致，表明該聯合藥物未誘發試驗菌株基因突變。

表1 聯合藥物的細菌回復突變試驗結果（±s，n=3）

2.3 體內微核試驗

從表2可見，陽性對照組的微核率均高于陰性對照組（

P＜

0.01），各組的PCE/NCE值均在正常值（0.6～1.2）范圍且差異無統計學意義（

P＞

0.05），表明在本試驗劑量范圍未出現骨髓抑制作用，試驗體系可靠。聯合藥物各劑量組的微核率均高于陰性對照組，差異有統計學意義（

P＜

0.01），試驗結果為陽性。

表2 聯合藥物對小鼠骨髓細胞微核的影響

2.4 精原細胞染色體畸變試驗

結果見表3。陽性對照組可見染色體斷裂、斷片、微小體、環形等改變，染色體畸變細胞率顯著高于陰性對照組（

P

＜0.01），表明試驗體系可靠。聯合藥物各劑量組小鼠的精原細胞染色體的多倍體數目和染色體畸變類型（斷裂和裂隙），及畸變細胞率（畸變細胞數/觀察細胞數×100%）與陰性對照組比較，差異均無統計學意義（

P

＞0.05）。

表3 聯合藥物對小鼠精原細胞染色體畸變率的影響（n=500）

3 討論

抗病毒藥物聯合治療是我國目前實行免費治療使用的HIV PMTCT治療方案，實行多年以來，已經明顯降低HIV的母嬰傳播率，但不時有服藥后引起不良反應的報道，如胃腸道反應、疲乏、肝和腎臟毒性、骨髓抑制、皮疹等。為了評價聯合藥物AZT+3TC+LPV/r的安全性，本研究對該聯合藥物的急性毒性進行檢測，并采用體外細菌回復突變試驗、哺乳動物體內骨髓細胞微核試驗和精原細胞染色體畸變試驗，研究該聯合藥物的致突變性。

在給予該聯合藥物后，小鼠未出現中毒體征和死亡，小鼠的急性經口毒性LD大于5 000 mg/kg，表明聯合藥物無急性經口毒性作用。體外試驗，在加和不加S代謝活化系統兩種條件下，該聯合藥物5個劑量組的5種試驗菌株的回變菌落數與自發回變的菌落數相接近，回復突變試驗結果為陰性。該聯合藥物3個劑量組雌、雄性動物的微核細胞率在4.4‰～5.2‰之間，與陰性對照組比較差異均有統計學意義（

P

＜0.01），并高出本實驗室的正常本底值（0.4‰～3.6‰），為陽性試驗結果，但試驗檢測結果顯示微核率與陰性對照組的微核率上限值5‰很接近，故其毒理學意義尚不確定。本試驗未觀察到受試物對骨髓的抑制作用（PCE/NCE比值未降低），與臨床觀察到的骨髓抑制不良反應不一致，原因可能與用藥時間、劑量不同及種屬間敏感性差異等因素有關。微核率增高通常是受到染色體斷裂劑作用的結果，而骨髓抑制是化療藥物對骨髓的毒性反應，兩者產生的機制不同，后者一般對粒細胞系影響最大，其次為血小板，而紅細胞系由于半衰期長，所以影響不明顯。該聯合藥物3個劑量組的精原細胞畸變細胞率與陰性對照組比較未見明顯增高，試驗結果為陰性。

綜上結果，聯合藥物AZT+3TC+LPV/r無急性經口毒性作用，體外細菌回復突變試驗和小鼠精原細胞染色體畸變試驗結果均為陰性，而骨髓細胞微核試驗結果為陽性，該聯合藥物的致突變性有待進一步探討和驗證。