子宮內膜癌保育治療孕激素耐藥分子機制的相關研究進展

王露露（綜述） 呂巧英 羅雪珍（審校）

（復旦大學大學附屬婦產科醫院婦科 上海 200011）

子宮內膜癌（endometrial cancer，EC）是最常見的女性生殖系統腫瘤之一，其發病率逐年增高，并呈低齡化趨勢，44歲以下的年輕患者約占發病總人數的7%［1］。對于有強烈的生育愿望，并經嚴格篩選的早期（Ⅰa期，G1）子宮內膜樣癌患者，可采用高效孕激素進行保留生育功能治療。孕激素能夠拮抗雌激素刺激，抑制細胞增殖、促進分化，逆轉惡性表型，發揮抗癌作用，但是治療過程中出現的耐藥，卻使得30%左右患者治療失敗，甚至出現了病情惡化。臨床薈萃分析顯示，孕激素治療子宮內膜不典型增生患者的完全治愈率為66%～74%，早期子宮內膜樣癌的完全逆轉率為49%～72%［2］。解析子宮內膜孕激素敏感性的調控機制是解決孕激素耐藥的關鍵環節。孕激素主要通過激活孕激素受體（progesterone receptor，PR）下游的信號通路發揮生物學效應。多項臨床試驗表明，接受孕激素保育治療的子宮內膜不典型增生和早期子宮內膜癌患者中，PR陰性患者往往孕激素治療反應性不佳［3］。也有幾項小樣本前瞻性臨床試驗表明，PR陰性組存在部分患者（18%～50%）對孕激素有反應性，孕激素治療有效［4-6］。因此，歐洲婦科腫瘤學會（ESGO）提出可對PR陰性的患者試行孕激素保育治療［7］。但目前大多數指南仍然建議在接受保育治療前監測患者癌組織PR表達情況，對于PR弱表達或者陰性的患者，不推薦進行保育治療［8］。所以，子宮內膜癌患者孕激素敏感性高低很大程度上取決于PR的水平和功能。本文旨在通過對孕激素受體的作用機制進行闡述，對影響子宮內膜孕激素效應的因素進行分析總結，從而指引子宮內膜癌孕激素耐藥的干預新策略。

孕激素受體及其功能PR是類固醇受體超家族的一員，可分為核受體和膜受體。未被激活的核受體位于胞質內，與孕激素結合后入核，作為核轉錄因子調控靶基因的表達水平，這也是孕激素的主要作用途徑。而位于細胞表面的孕激素受體與孕激素的結合力弱，其確切的生物學功能尚存在爭議。所以本文主要針對核孕激素受體的生物學功能展開討論。

PR主要可以分為A亞型（progesterone receptor A，PRA）和B亞型（progesterone receptor B，PRB）。PRA（94 000）和PRB（116 000）是由位于11號染色體（11q22-q23）的PGR基因在不同啟動子的控制下轉錄生成的兩種在結構上極為相似的蛋白。二者唯一的不同在于PRB氨基端起始比PRA多了164個氨基酸，這可能是造成PRA和PRB功能差異的關鍵。

既往研究認為PRA和PRB具有相反的生物學作用，PRB是高度活躍的核轉錄因子，而PRA則會抑制PRB的轉錄活性，子宮內膜孕激素敏感性與PRA/PRB會呈現負相關趨勢，即PRA/PRB越低，孕激素敏感性越高。但陸續有研究證實，PRA和PRB之間的相互作用更為復雜。利用全基因表達分析技術，研究人員發現PRA、PRB都具有轉錄調節活性，可以作用于多種內源性啟動子，調節不同的靶基因。人子宮內膜間質細胞（human endometrial stromal cells，HESCs）可同時表達PRA和PRB。Kaya等［9］利 用siRNA技 術 靶 向 敲 低HESCs的PR水平，再通過腺病毒載體轉導，使其特異性表達PRA或者PRB，以此來研究PRA、PRB的生物學作用差異。Chip-seq結果顯示，PRA、PRB分別有6552和13407個全基因組結合位點，包括5177個共有位點。另外，PRB還可作用于PGR上的PRA啟動子序列，直接上調PRA的表達。接下來作者利用微陣列分析對兩種亞型所調控的基因集進行了對比，發現與敲除PGR的HESCs相比，PRA陽性、PRB陽性、PRA和PRB雙陽性的間質細胞直接或間接調控的基因數量分別為451、1724、1636，三者之間存在不同程度的交集。PRA特異性調控某些蛋白激酶和凋亡相關轉錄因子的表達，例如TNFSF12，BCL 6，MCL 1等。PRB特異性抑制包括CDK1，CCNB1，CCNB在內的多種細胞周期相關調控分子水平，發揮抑制細胞增殖的作用。兩種受體同時表達時，差異基因主要與PRB相關，但PRA對于PRB的轉錄活性存在抑制作用，因為研究結果表明，相較于單獨表達PRB，同時存在兩種亞型的情況下，部分PRB靶基因表達量出現了不同程度的下調。以上研究證實，PRA、PRB均具有轉錄調節活性，二者所調控的下游基因網絡存在交叉，但也不乏各自的特異性。并且，兩種亞型相互影響，表現在PRB對于PRA表達水平的調控，以及PRA對于PRB轉錄活性的調控。

PRA和PRB的表達水平具有組織細胞特異性，在子宮內膜上皮和間質細胞中發生周期性動態變化，使得子宮內膜對于孕激素的反應性呈周期性變化。子宮內膜增生期，在高雌激素作用下，子宮內膜上皮和間質細胞處于增殖狀態，PRA和PRB水平在雌激素作用下也逐步上升，此時，子宮內膜上皮細胞中PRA/PRB≈1，子宮內膜間質細胞中PRA/PRB>1，孕激素敏感性增高，為分泌期做好準備。子宮內膜分泌期，黃體分泌孕激素逐漸增多，子宮內膜間質在孕激素的作用下分泌反應增加，增殖受到抑制，即雌激素的促增殖效應被孕激素所拮抗。同時，孕激素作用下PRB的表達水平在兩種組織類型中均出現降低，而PRA的表達水平僅僅在上皮細胞中明顯降低，間質細胞PRA表達量仍然維持高水平，孕激素敏感性出現回落［10-11］。

由此可知，PR的亞型表達水平、組織定位、功能活性都是影響子宮內膜癌孕激素敏感性的重要因素。

影響子宮內膜癌孕激素敏感性的分子機制

受體水平PR表達水平降低以及亞型失衡 孕激素主要通過激活PR發揮抑制腫瘤細胞增殖，促進子宮內膜向分泌期轉化的生物學效應。所以，子宮內膜PR蛋白表達水平與其孕激素敏感性息息相關，低表達PR或者治療過程中出現的PR表達水平下調可能是產生子宮內膜癌孕激素耐藥的分子機制之一。最新的臨床薈萃分析研究報道，PR陽性的子宮內膜不典型增生和早期內膜癌患者對于孕激素保育治療的反應性更高［12］。PRA和PRB在孕激素治療過程中都可以作為預測激素敏感度的生物學標志，但是哪一亞型在孕激素抗腫瘤效應中起主要作用，仍存在爭議。目前大部分研究認為，相較于PRA，PRB在孕激素抑制腫瘤細胞的增殖、侵襲中起主導作用［12］。但Conneely等［13］通過研究證實了PRA在拮抗雌激素方面的重要地位。研究人員特異性敲除小鼠子宮內膜PRA，在PRB單獨作用下，孕激素抗細胞增殖作用減弱，子宮內膜出現不典型增生過長。子宮內膜中PR亞型的分布具有細胞特異性，間質細胞主要表達PRA，而上皮細胞主要表達PRB，兩種亞型在不同細胞類型中的下游信號以及靶基因調控有所不同，受體表達水平也隨著內膜微環境改變發生動態變化，共同調節內膜細胞增殖、分化［14］。相較于研究某一種亞型，PRA、PRB在上皮、間質中的比例失衡、孕激素受體上皮-間質間的信號傳導差異和相互作用是未來的研究重點。目前多數研究對PR亞型的組織細胞特異性不夠重視，盡管對于PR亞型進行了區分，但很少針對組織類型進行區分研究，體外試驗也主要是利用子宮內膜上皮腫瘤細胞系，存在很大的局限性。

PGR的表觀修飾 PGR啟動子的5’上游區域包含Cp G島，Cp G島的異常甲基化會引起相關基因的沉默。在子宮內膜癌中，DNA啟動子和外顯子區域的異常甲基化會導致PGR表達下降，在轉錄水平抑制孕激素受體的表達，下調腫瘤細胞的孕激素敏感性，并且與子宮內膜癌不良的預后結局相關［15］。雖然PRA與PRB都由PGR基因轉錄生成，但是二者由不同的啟動子進行調控，這可能會導致兩種受體亞型的表觀修飾模式存在差異。通過對子宮內膜癌細胞系和腫瘤組織進行研究，學者證實了PGR甲基化修飾在PRB啟動子區域尤為顯著，并伴隨PRB表達下降和孕激素敏感性減弱［16］。DNA甲基轉移酶抑制劑和組蛋白去乙酰化抑制劑使用可以提高子宮內膜癌細胞PRB的表達，增強孕激素受體對FOXO1，p21，p27等靶基因的調控［17］。導致PGR甲基化的機制尚不明確，可能與PTEN、KARS等基因突變，長鏈非編碼RNA（HOTAIR）過表達有關［18-19］。

PR的翻譯后修飾 翻譯后修飾（posttranslational modification，PTMs）會影 響孕激素受體的穩定性、亞細胞定位、轉錄活性以及靶基因的選擇。常見的PTMs形式包括磷酸化修飾、泛素化修飾、類泛素化（SUMO化）修飾。孕激素受體氨基端存在多個絲氨酸（serine，Ser）磷酸化位點，可以被MAPK、CDK2、CK2等多種激酶選擇性磷酸化，對孕激素受體的功能結構產生不同的影響。例如，MAPK可選擇性磷酸化PRB的Ser294和Ser345位點，促進PR入核，激活其對靶基因的調控［20］。與此同時，Ser294的磷酸化可誘導PR發生泛素化修飾，下調PR表達，引起泛素化-26S蛋白酶體介導的配體依賴性PR蛋白降解［21］。泛素化雖然可導致PR水平快速下調，但研究表明，泛素化降解也是PR活化下游信號通路的重要條件。Yang等［22］使用MAPK抑制劑PD0325901抑制子宮內膜癌細胞PR磷酸化，24h后檢測癌細胞PR蛋白表達水平。實驗結果表明，磷酸化被抑制后，泛素化介導的PR蛋白降解隨之減少，子宮內膜癌細胞PR水平得以維持。但后續實驗表明未降解的PR并不具備轉錄激活作用，PR靶基因AREG、PAEP mRNA表達水平在孕激素作用下未出現相應的升高。研究人員還收集了子宮內膜患者孕激素治療前后的癌組織標本，免疫組化結果顯示，在孕激素作用下，內膜癌組織病理類型出現逆轉，同時伴有子宮內膜癌組織中PR水平的明顯下調，驗證了上述結論。所以PR陽性并不等于孕激素敏感，“無功能”PR不能被泛素化降解，無法正常調控下游基因。SUMO化也是類固醇受體重要的翻譯后修飾形式。ABDEL-HAFIZ等報道［23］，PR氨基端的K388位點存在SUMO結合共有序列，并且該位點的SUMO化依賴于孕激素與PR的結合。SUMO化會抑制PR的轉錄活性，相較于未經SUMO化的孕激素受體，SUMO化孕激素受體的轉錄活性會降低6～10倍。目前PR翻譯后修飾的研究背景以乳腺癌居多，但PR在乳腺組織和子宮內膜組織中具有不同的生物學功能，所以需要更多的研究來分析翻譯后修飾在內膜癌中所扮演的角色。

受體后水平協同調節因子異常表達 類固醇受體需要通過募集協同調節因子完成其對靶基因的調控，可分為促進轉錄的協同刺激因子和抑制轉錄的協同抑制因子。協同調節因子復合體具備染色質重塑酶活性，可以引起局部染色質乙酰化或者去乙酰化。乙酰化會使得染色質松弛或開放，所以在高乙酰化位點觀察到轉錄活性增加，而在低乙酰化區域觀察到活性降低。可見，協同調節因子在PR與染色質DNA之間起到了“橋梁”作用。多項研究表明，在乳腺癌、前列腺癌等激素依賴性腫瘤中存在SRCs等協同調節因子表達水平異常增高或降低，可繼發腫瘤對激素治療不敏感或抵抗［24］。SRC家族是較早發現的協同刺激因子，主要包括3個成員——SRC-1、SRC-2、SRC-3，對于調節PR的轉錄活性和子宮內膜孕激素反應性至關重要［25］。多項研究證實子宮內膜癌微環境中存在PR協同調節因子表達異常，表現為SRC-2、SRC-3表達異常增高，SRC-1表達降低，伴孕激素受體表達下降，孕激素反應性減弱［26-27］。因此，子宮內膜癌微環境中孕激素受體協同調節因子的異常表達很可能介導了腫瘤細胞孕激素反應性的降低，相關分子機制尚不明確，可能與孕激素受體AF1功能區突變，協同因子招募功能減弱有關［28］。

PR下游靶基因的改變 PR在核外與c-SRC相互作用后可以激活ERK/MAPK和AKT通路，間接調控下游靶基因。這是PR所介導的快速、間接的基因調控。而PR經典作用機制是作為核轉錄因子，調控下游靶基因，發揮對抗細胞增殖、促進分化的作用。目前已知的PR下游靶基因包括IHH、HOXA 10、FOXO1、DKK1、IGFBP-1、CyclinD1（CCND1）、p27（CDKN1B）、p21（CDKN1A）等［10，25］。靶基因表達產物以自分泌和旁分泌的形式實現上皮-間質細胞增殖分化的調節，下文中以靶基因IHH和FOXO1為例作簡要說明。子宮內膜上皮細胞PR激活之后可上調IHH表達，而IHH通過誘導間質細胞COUPTFII、Ptch1、Hand2等下游信號分子，抑制FGFs等生長因子激活上皮細胞ERK/MAPK、AKT通路，從而拮抗雌激素的作用［29］。另一個PR關鍵性靶基因FOXO1主要是由子宮內膜基質細胞PRB調控的一類轉錄因子。有報道［30］，PRB可通過上調FOXO1，抑制子宮內膜上皮細胞增殖，促進間質細胞分化。FOXO1與IGFBP-1啟動子區域結合后，引起IGFBP-1水平升高，對于PR介導的抗上皮細胞增殖至關重要。研究人員利用siRNA敲低子宮內膜上皮細胞FOXO1后發現，低表達FOXO1時，孕激素抑制細胞增殖的能力被大大削弱。近期有研究初步證實，孕激素耐藥的子宮內膜癌細胞中，FOXO1的mRNA水平顯著降低［31］。PR其他的靶基因，如HOXA 10、p21、p27等，也是PR相關信號通路重要的效應執行分子。

綜上所述，作為PR相關信號通路的效應分子，PR下游的靶基因如果發生突變或被異常修飾，喪失功能，即使內膜組織中PR表達為陽性，其對孕激素反應性仍然不佳。

PR相關信號通路異常 PR介導的信號通路還會與其他的分子信號通路存在交互作用，某些信號通路的異常激活或抑制可能對子宮內膜癌細胞的PR表達水平以及孕激素敏感性產生影響。目前已知與孕激素敏感性相關的信號通路主要包括：

（1）腫瘤凋亡通路。富有成效的孕激素治療一般伴有腫瘤細胞的增殖抑制、凋亡等現象。FASFASL相互作用是誘導細胞凋亡的重要途徑之一。有研究證實［32］，孕激素可通過上調子宮內膜腺上皮FAS、FASL的表達，發揮抗癌作用。對孕激素不敏感的內膜癌患者腫瘤組織中FAS、FASL的表達明顯下調，這可能是子宮內膜癌發生耐藥的機制之一。

（2）EGFR信號通路。AI等［33］研究發現，子宮內膜癌孕激素耐藥的發生伴有腫瘤微環境中內源性生長因子TGFa/EGF、表皮生長因子受體（EGFR）、EGFR酪氨酸激酶（EGFR-TK）表達增高。生長因子可引起EGFR自身磷酸化，EGFRTK活性增強，進一步活化細胞內MAPK信號通路，導致細胞分裂增殖，同時還可導致PR表達下降。

（3）PI3K-AKT信號通路。PI3K/AKT信號通路與細胞增殖和凋亡密切相關。Gu等［34］報道了PI3K/AKT信號通路活化對于PR的抑制作用。長期使用孕激素治療可引起PR的下調，此時孕激素可通過非PR途徑活化PI3K/AKT信號通路，促進內膜癌細胞增殖，抑制其凋亡，引起腫瘤的進展。同時，異常活化的PI3K/AKT信號通路會進一步下調PR的表達，促進孕激素敏感度進一步下降。應用AKT通路抑制劑LY 294002后，內膜癌PRB表達水平升高，對孕激素的敏感性增強。

（4）其他。多項研究報道了survivin、HE4、GloI、SIRT 1等分子表達異常，可調節PR表達水平，影響腫瘤細胞對于孕激素敏感性，可應用于孕激素治療效果的預測［35-37］，但具體的信號分子機制和臨床試驗還未開展，對于孕激素反應性預測的敏感度和特異性尚不清楚。另外，利用微陣列分析、基因共表達網絡分析，Li等［35］發現了可能與孕激素耐 藥 相 關 的 基 因 ，包 括ANO1、SOX17、CGNL 1、DACH 1、RUNDC3B、SH 3YL 1和CRISPLD1，這些基因表達產物可能對PGR表達水平或者PR下游信號通路產生負性調控作用，誘導孕激素耐藥。

代謝-免疫-腫瘤微環境子宮內膜癌的發生發展與代謝息息相關，已證實，肥胖、胰島素抵抗等代謝異常均為其獨立危險因素。近期有學者證實，存在胰島素抵抗、體重超標的子宮內膜不典型增生患者接受孕激素治療需要更長的治療周期，表明代謝紊亂可抑制機體的孕激素反應性［38］。一項前瞻性隨機對照臨床試驗表明，胰島素增敏劑二甲雙胍可以提高內膜癌以及非典型增生病人保育治療的效果。所以，肥胖和胰島素抵抗可能協同導致了孕激素耐藥的發生［39］。肥胖和胰島素抵抗可能主要通過以下兩種機制導致子宮內膜癌發生孕激素治療耐藥：（1）外周以及局部雌激素生成過多。研究表明，肥胖可以促進卵巢以及周圍脂肪組織中雌激素的產生，并且可間接下調性激素結合球蛋白（sex hormone-binding globulin，SHBG），引起循環中雌二醇水平升高［40-41］。另外，高胰島素微環境能夠上調內膜癌細胞G蛋白耦聯雌激素受體（G-proteincoupled estrogen receptor，GPER）的表達水平，增加腫瘤細胞對雌激素的敏感性，從而促進腫瘤細胞的增殖［42］。（2）子宮內膜微環境的慢性炎癥狀態。肥胖和胰島素抵抗是多囊卵巢綜合征（polycystic ovary syndrome，PCOS）患者常合并的代謝異常。研究人員收集了PCOS患者與正常女性分泌期內膜組織進行差異基因分析，結果表明PCOS患者內膜組 織 中PR下 游 靶 基 因 ，如GAB1、LIF、GAB2，mRNA表達水平明顯低于正常內膜組織，驗證了PCOS患者的孕激素抵抗性［43］。后續研究表明，PCOS患者孕激素反應性低下可能與代謝異常引起的子宮內膜微環境慢性炎癥狀態有關，免疫微環境的改變可引起子宮內膜間質細胞無法正常蛻膜化，出現孕激素抵抗［44］。LI等［35］利用微陣列分析技術對孕激素耐藥和敏感的子宮內膜癌細胞差異基因進行篩選，再通過GO/KEGG對差異基因進行富集分析，發現差異基因主要富集于脂肪代謝、免疫功能調節和炎癥相關通路，驗證了孕激素耐藥與代謝、免疫之間的聯系。胰島素抵抗和肥胖可誘發機體的慢性炎癥狀態，影響腫瘤微環境中的免疫細胞，如巨噬細胞、CD8+T細胞、NK細胞等的增殖分化以及免疫活性，同時伴隨有促炎細胞因子、趨化因子的釋放，促進腫瘤發展。腫瘤相關巨噬細胞，即M 2型巨噬細胞，是慢性炎癥微環境中重要的免疫細胞。GALVAN等［45］研究發現，在前列腺腫瘤中，肥胖相關性腫瘤微環境可募集巨噬細胞，并且通過COX-2/PGE2途徑誘導巨噬細胞表型向腫瘤相關巨噬細胞極化。而在子宮內膜癌中，與正常增生期內膜相比，M 2型巨噬細胞在子宮內膜癌中浸潤增多。M 2型巨噬細胞可通過釋放多種細胞因子，如TNF-α、IL-1β、IL-6和氧自由基，促進子宮內膜癌進展。TNF-α和IL-1β可能通過表觀修飾直接下調PR的表達水平。促炎因子還可與PR競爭協同調節因子、干擾PR與FOXO1的相互作用，從而影響孕激素發揮調節作用［38］。另外，自由基的生成和氧化應激信號通路的激活，可通過改變PR翻譯后修飾的形式改變受體的功能狀態［46］。因此，M 2型巨噬細胞可通過分泌細胞因子、自由基抑制內膜孕激素敏感性，誘導孕激素治療不敏感。

綜上所述，代謝因素可通過改變腫瘤微環境中巨噬細胞的免疫活性影響孕激素受體信號通路中的中間環節，促成了代謝-免疫-腫瘤耐藥的過程。異常代謝背景下，腫瘤微環境中的其他免疫細胞對于孕激素受體是否存在類似的抑制效應還有待研究，是十分具有潛力的研究方向。

結語子宮內膜癌是一種與激素水平、代謝異常密切聯系的女性生殖系統腫瘤。近年來，越來越多的研究驗證了代謝紊亂對腫瘤微環境的影響。然而，目前對孕激素耐藥方面的研究較為松散和片面，往往只針對某個分子、某個通路，不同的研究之間很少有關聯或者遞進。另外，子宮內膜干細胞異常在子宮內膜癌的發生、發展、孕激素耐藥中發揮的作用亦是目前的研究熱點。子宮內膜干細胞內部異常活化信號與孕激素受體下游通路間存在多交叉現象，可能干擾子宮內膜癌對孕激素的敏感性。

今后對于子宮內膜癌孕激素耐藥機制的研究可以子宮內膜癌患者的代謝特征為背景，將腫瘤微環境的代謝-免疫特征與孕激素受體上下游信號通路相關分子相結合，同時可對子宮內膜干細胞與孕激素敏感性之間的關系開展相關研究，為從根本上解決孕激素耐藥現象提供新靶點、新思路。

作者貢獻聲明王露露 數據采集，論文構思、撰寫和修訂。呂巧英，羅雪珍 論文構思和修訂。

利益沖突聲明所有作者均聲明不存在利益沖突。