2017—2019年CD (SD)大鼠240個SNP位點遺傳檢測結果分析

龍煙朦 鄭天威 張巧稚 苗向南 田 軍 尹良宏 韓 雪

(北京維通利華實驗動物技術有限公司，北京 100107)

CD(SD)大鼠(以下簡稱CD大鼠)作為常用封閉群品系之一，廣泛用于毒理學[1-2]、老齡化研究[3]、腫瘤學[4-5]等領域研究數十年。動物實驗的可重復性與數據的準確性取決于實驗動物的遺傳質量是否得到保證。然而隨著時間的推移及地理上的隔離，在動物的繁育與飼養過程中，遺傳漂變、近交繁殖等會導致動物種群基因，甚至表型(如：對化學藥物的敏感性[6])發生變化，從而造成種群內遺傳多樣性流失，種群間產生較大的遺傳差異[7]。為了解決上述問題并確保CD大鼠種群繁育穩定，1992年美國Charles River Laboratories(CRL)的專家們與群體遺傳學家、營養學家、病理學家和藥理學家共同商討國際遺傳學標準(International Genetics Standardization，IGS)種群管理方案，應用于全球不同國家各個設施CD大鼠種群，以保證各地生產群的基因分布(等位基因譜)更接近一致。同時，定期對核心群及全球各設施動物進行遺傳監測，通過比較不同群體間的遺傳差異來確保動物的遺傳質量[8-9]。單核苷酸多態性(SNP)作為第三代遺傳標記，因其具有攜帶信息量大、操作簡單、敏感度高、結果可重復性強等優點而廣泛用于生態學研究，現已用于大、小鼠的遺傳質量檢測[10-11]。維通利華一直按照IGS方案對CD大鼠進行管理以保證該封閉群的雜合度，并已連續三年參與CRL對全球多設施CD大鼠種群的遺傳檢測。本研究旨在對2017—2019年三次檢測結果進行分析，對維通利華的CD大鼠種群內的遺傳多樣性及與美國基礎群遺傳分化程度進行評估。

1 材料和方法

1.1 樣品的采集與處理

送檢樣本采集于SPF級CD大鼠，來自北京維通利華實驗動物技術有限公司，實驗動物生產許可證號：SCXK(京)2016-0006。2017—2019年在各送檢種群中，隨機選取8只25 d齡以上的大鼠，雌雄各4只，采集耳樣。其中，2017年送檢1個種群(種群編碼：CN01)，2018年送檢4個種群(種群編碼：CN-1801、CN-1802、 CN-1803和CN-1804)，2019年送檢6個種群(種群編碼：CN-1901、CN-1902、CN-1903、CN-1904、CN-1905和CN-1906)，三年累計共檢測11個種群，88個樣品。使用75%乙醇對刀片進行消毒后，在每只個體耳朵外緣用刀片切取2～5 mm樣品。樣品放置在無菌8連管中，進行標記編號。采樣結束后，將樣品放置于-20 ℃暫存，后送至美國Charles River RADS實驗室。使用QIAGEN柱式提取法提取耳樣中的DNA。

1.2 基因型分型

在基因芯片(Taqman Open Array, ThermoFisher)上通過終點熒光PCR對240個SNP位點進行基因分型。每個位點上的兩個等位基因由一對互補的寡核苷酸Taqman熒光探針并標記，其一使用熒光染色劑VIC，另一使用FAM標記。之后，用Quant Studio 12 K Flex 實時熒光PCR儀測量VIC和FAM信號，并分析這些反應。使用TaqMan Genotyper軟件(V1.3, ThermoFisher)收集SNP分型為純合子(VV或FF)或雜合子(VF)的數量。NC代表該基因型未被收集，通常是由于擴增量太少造成。

1.3 數據分析

對2018—2019年維通利華群體SNP基因型進行卡方檢驗(χ2)，驗證群體是否處于哈迪-溫伯格平衡。使用GenA1Ex 6.5 群體遺傳學分析軟件對SNP基因分型結果進行處理和分析，并計算出位點多態性(P)、觀測雜合度(Ho)、期望雜合度(HE)、近交系數(F)和遺傳分化系數(FST)[12-13]，通過比較以上指標來評估維通利華CD大鼠種群的遺傳雜合度以及與美國CD大鼠基礎種群間的遺傳差異。

2 結果

除去若干SNP純合位點和1個SNP位點偏離哈迪-溫伯格平衡，維通利華2018—2019年送檢的群體在其余分別有效的188和184個SNP位點均符合哈迪-溫伯格平衡(HWE-P<0.05)。

2.1 2017年檢測結果

2017年送檢中國屏障房間、美國Wilmington基礎群(US-FNDTN)等共7個亞群52只CD大鼠耳樣。如表1所示：240個SNP位點中，除15個與X染色體相關的位點及5個無法精確測定而被剔除的位點，剩余220個SNP，檢出率在99.8%～100%。維通利華送檢亞群CN-1701，SNP位點回收率分別為：雄性100%，雌性99.8%。P為73.6%，Ho為0.29，HE為0.28，F為-0.02。中國各亞群與美國基礎群(US-FNDTN)的遺傳分化系數(FST)為0.056。

表1 2017年Crl: CD大鼠240個SNP位點檢測結果

2.2 2018年檢測結果

2018年送檢中國的屏障亞群、美國Wilmington基礎群(US-FNDTN)等共15個亞群144只CD大鼠耳樣，其中送檢4個亞群(CN-1801、CN-1802、CN-1803和CN-1804)，如表2所示：240個SNP位點中，除15個與X染色體相關的位點和5個無法精確測定而被剔除的位點，剩余220個SNP位點，回收率達到99.8%～100%。US-FNDTN種群有84%表現多樣性，維通利華亞群的P在73.3%～79.6%。F為0.11，中國送檢群的F范圍在-0.08～0。中國各亞群與美國基礎群的FST在 0.027～0.039。

表2 2018年Crl: CD大鼠240個SNP位點檢測結果

2.3 2019年檢測結果

2019年送檢中國亞群、美國Wilmington基礎群(US-FNDTN)等共21個種群196只CD大鼠耳樣，其中維通利華送檢6個亞群(CN-1901、CN-1902、CN-1903、 CN-1904、CN-1905和CN-1906)。如表3所示：240個SNP位點，除15個與X染色體相關的位點和5個不能準確測量的位點之外，剩余220個位點，收集率99.1%～100%。美國基礎群的P為84.5%，中國種群的P為71.5%～75.9%。美國基礎群的F為0.12，中國亞群的在-0.14～0.03。中國各亞群與美國基礎群的FST在0.029～0.046。

表3 2019年Crl: CD大鼠240個SNP位點檢測結果

3 討論

P是位點表現為多態性的比例，是評估種群內基因多樣性的指標。數值越高，說明雜合度越高，種群內遺傳變異程度越大。2017—2019年維通利華送檢種群的P平均值為73.6%，76.9%和74.2%。數據顯示CRL各種群內具有高度的基因多樣性并保持穩定。

根據Wright等[15]報道FST可以反映種群間遺傳分化程度，FST<0.05表示種群間分化程度很小，FST在0.05～0.15表示種群間存在中度遺傳分化差異，FST>0.25則分化程度很大。由結果可知， 2017—2019年維通利華種群與美國基礎群的FST在0.05上下波動，有5%左右的遺傳變異是種群間差異導致，95%源自種群內部的遺傳多樣性，遺傳分化程度呈低至中等。這說明定期從基礎群引種及更新種群，有利于持續保持與基礎群，以及其他種群的遺傳分化程度符合要求。

作為封閉群動物，CD大鼠種群的遺傳變異和雜合度逐漸減小主要是因為：(1)遺傳的瓶頸效應：種群的初始有效數量受限，導致基因多樣性匱乏。加速近親繁殖[9]，并導致近交衰退，有害等位基因的純合度增加，個體適應性越來越差；(2)抽樣誤差：對于后備種鼠的選擇標準不統一[7]，甚至飼養人員的經常變動或經驗不足也會加大遺傳差異[16]，進一步放大瓶頸效應[9]；(3)近親繁殖，放大遺傳漂變和基因突變的積累效應[17]，加速基因多樣性的流失。

維通利華沿用CRL對封閉群動物使用的IGS標準，采取多種管理措施來限制近交繁殖和控制種群遺傳差異，并定期檢測種群多態性，對群體間相似性和群體內的異質性做出分析和評估，并調整種群管理和生產的細節[9]，以減少對動物遺傳質量的影響。

上述連續三年的送檢結果表明：通過嚴格執行IGS標準對維通利華CD大鼠種群進行管理，種群符合隨機交配繁殖，種群內遺傳多樣性豐富且保持穩定，與CRL美國基礎群呈小～中等程度的遺傳分化，其良好的遺傳質量有助于動物實驗結果的可靠性和可重復性。定期送檢與美國核心群CD大鼠種群進行對比，對于評估種群穩定有重要意義。從結果來看，近三年主要關注中國種群與美國核心群的對比，本地同一群體不同年份的比較未涉及，后續將會對同一群體進行更多比對工作，進行針對性的研究。